Le rôle d'une sérine-thréonine phosphatase de type 2C parasitaire (TgPP2C) dans l'interaction Toxoplasma gondii - cellule hôte : Identification des modules interactifs au sein du tricomplexe actine-toxofiline-TgPP2C et étude de ses propriétés fonctionnelles dans le parasite et la cellule infectée
Résumé
Toxoplasma gondii, le protozoaire intracellulaire obligatoire responsable de la toxoplasmose, fait partie du phylum des Apicomplexa. Comme les autres membres de ce phylum, il a développé des propriétés mobiles particulières qui lui permettent de se déplacer et d'envahir très rapidement la cellule dans laquelle il se multiplie. Ces processus de locomotion et d'invasion sont dépendants du cytosquelette d'actine du parasite. Une protéine, la toxofiline, identifiée uniquement chez T. gondii, a été caractérisée au laboratoire comme étant capable de réguler la dynamique du cytosquelette d'actine. Plus précisément, la toxofiline séquestre l'actine monomérique, empêchant ainsi sa polymérisation. L'affinité de la toxofiline pour l'actine est modulée par phosphorylation/déphosphorylation par une caséine kinase 2 et une sérine-thréonine phosphatase de type 2C (TgPP2C). Mon projet de thèse a porté sur l'étude du rôle de la TgPP2C dans l'interaction entre T. gondii et sa cellule hôte. Le premier objectif de mon travail a été de disséquer les interactions moléculaires entre les trois membres du complexe actine G - toxofiline - TgPP2C. J'ai ainsi identifié, par différentes approches biochimiques, les régions et les acides aminés de la toxofiline, critiques pour sa liaison avec ses deux partenaires. Tout d'abord, la toxofiline possède un domaine suffisant pour lier et séquestrer l'actine G dans des tests de polymérisation. Ce domaine, qui a été appelé CC1A, correspond à une région de 9 kDa comprenant un domaine en super hélice. Trois séries de peptides chevauchants, présents dans CC1A, capables de lier l'actine G, ont été plus précisément détectés. Nous avons également identifié d'autres régions de la toxofiline ayant des propriétés de liaison différentes à l'actine, en particulier dans le domaine N-terminal (NoCC). Le premier domaine en super hélice, et en position C-terminale de CC1A, lie la TgPP2C. Une autre séquence de plusieurs acides aminés, dans la région N-terminale et contenant la sérine 53, substrat de la TgPP2C, interagit avec la phosphatase. Le deuxième objectif de mon projet de thèse a porté sur l'analyse des propriétés fonctionnelles de la TgPP2C dans le tachyzoïte. Par une stratégie de surexpression dans les parasites, nous avons tout d'abord montré que la TgPP2C jouait un rôle dans la multiplication du parasite. En effet, des tachyzoïtes qui surexpriment la forme active de la TgPP2C ne se divisent pas normalement dans la vacuole parasitophore et finissent par dégénérer. On observe des parasites anormaux avec un noyau géant, qui suggère un défaut dans la division nucléaire ou l'individualisation des cellules filles. Nous avons également mis en évidence que la TgPP2C est sécrétée par le parasite dans le cytoplasme et le noyau de sa cellule hôte. Cette sécrétion est dépendante du domaine N-terminal unique de 18 acides aminés de cette phosphatase. Enfin, le troisième objectif de mon travail a consisté à étudier le rôle de la TgPP2C dans la cellule infectée. Par une approche d'expression ectopique de la phosphatase dans des cellules de mammifère, nous avons mis en évidence que la TgPP2C agissait au niveau du cycle de ces cellules. En effet, les cellules qui expriment la phosphatase parasitaire sont bloquées en phase G2/M. Certaines cellules en division n'achèvent pas la cytocinèse et restent reliées par un long pont cytoplasmique contenant de l'ADN et la TgPP2C. A un temps plus tardif, elles présentent les signes caractéristiques d'une apoptose. D'autre part, nous avons réalisé un crible double hybride en levure afin d'identifier les partenaires hôtes de la TgPP2C. Plusieurs protéines candidates on ainsi été obtenues, dont la protéine Spire qui possède des propriétés de nucléation de l'actine in vitro et dont nous avons confirmé l'interaction avec la TgPP2C. La poursuite de cette étude permettra de caractériser l'effet de la TgPP2C sur Spire, et le rôle de cette dernière dans le développement des tachyzoïtes.
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