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Etude de complexes protéiques non covalents par spectrométrie de masse FT-ICR.
Les qualités analytiques de la spectrométrie de masse à résonance cyclotronique ionique et à transformée de Fourier, combinée à une source d'électronébulisation (ESI-FT-ICR) ont été mises à profit pour l'étude d'interactions non-covalentes dans des assemblages protéiques. Dans une première partie, l'utilisation de cette technique pour la détection de complexes protéiques intacts a été développée sur le système constitué de la créatine kinase (CK) et de ses ligands ADP et ATP, conduisant à l'observation de ces complexes en phase gazeuse. Les parts spécifiques et non spécifiques de ces interactions ont été séparées par un modèle statistique, conduisant à la détermination des constantes de dissociation (K1,ADP=11.8 ± 1,5 μM, K2,ADP=48 ± 6 μM, K1,ATP=27 ± 7 μM, K2,ATP=114 ± 27 μM ) qui sont en accord avec la littérature. Dans une seconde partie, des techniques pour l'étude de l'accessibilité de surface de complexes de protéines par modification chimique en solution, aussi bien réversibles (échanges H/D) qu'irréversibles (modification spécifique d'histidine et de lysine par le DEPC) ont été mises au point et appliquées. Les sites de modification ont été localisés soit par une approche « bottom-up » (digestion enzymatique suivie d'une mesure de masse des peptides résultants) soit par une approche « top-down » (fragmentation en phase gazeuse de la protéine intacte par dissociation par capture d'électrons [ECD]). Dans le cadre de l'instrumentation actuelle, cette dernière approche a conduit à des résultats pour des protéines allant jusqu'à 17 kDa et pourrait être étendue jusqu'à des protéines de 25 kDa. Ces différentes stratégies analytiques ont été appliquées à des oligomères de la protéine du prion (PrP) obtenus par dénaturation thermique partielle in vitro de l'espèce monomérique. L'accroissement de l'incorporation de deutérium dans certaines régions de la forme oligomèrique (par rapport au monomère) reflète un dépliement partiel de la protéine, en particulier au niveau d'une hélice .

2006-10-20
Chimie, physico-chimie et génie chimique
Ecole Polytechnique
Complexes protéiques – Masse FT-ICR
Noncovalent protein complexes studied by FT-ICR mass spectrometry.
The outstanding analytical performances of electrospray ionization Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry (ESI-FT-ICR MS) were applied to study non-covalent interactions in protein complexes. In a first part, the application of this technique to the detection of intact protein complexes was developed on the system of Creatine kinase (CK) and its ligands ADP and ATP, leading to the observation of these complexes in the gas phase. Specific and non- specific contributions of these interaction were separated by means of a statictical model, yielding interaction constants (K1,ADP=11.8 ± 1.5 μM, K2,ADP=48 ± 6 μM, K1,ATP=27 ± 7 μM, K2,ATP=114 ± 27 μM) that are in fair agreement with literature values. In a second part, methods to study the surface accessibility of protein complexes by chemical modification in solution, either reversible (H/D exchange) or irreversible (specific modification of His and Lys by DEPC) were developed and implemented. The modification site was identified either by a bottom-up (enzymatic digestion followed by mass measurement of the resulting peptides) or a top-down approach (gas phase fragmentation of the entire protein by electron capture dissociation [ECD]). Within the framework of the current instrumentation, the latter approach yields reasonable results for proteins as large as 17 kDa and should be extendible to 25 kDa. Application of the different analytical strategies yielded insight into the structure and conformational dynamics of prion protein (PrP) oligomers that were obtained by partial thermal denaturation of the monomeric species in vitro. Increase in deuterium incorporation in some regions of the oligomeric species (compared to the monomer) reflects partial unfolding of the protein, as indicated by the unfolding of an α helix.
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