Study of translation initiation factors eIF5B and eIF3
Etude des facteurs du démarrage de la traduction eIF5B et eIF3
Résumé
Translation initiation plays a central role in every living organism. Studying the proteins helping the ribosome toward this task, Initiation Factors (Ifs), allows to get insights into the complex molecular mechanisms ensuring a high fidelity and efficiency of translation initiation. When comparing the existing initiation factors in the three kingdoms of life, three universally conserved initiation factors were identified. Among these, the eukaryotic/archaeal factor e/aIF5B, the counterpart of the bacterial factor IF2, stimulates the ribosomal subunits joining step as in Bacteria. However, the universality of this factor was limited by the lack of reported interaction between the factor e/aIF5B and the initiator tRNA whereas such an interaction was characterized in Bacteria. A first part of this thesis work aimed at extending the functional similarity between the factors by bringing to light a binding of methionylated initiator tRNA by the factor e/aIF5B. The characteristics of this binding are very similar to the binding of formylated methionylated initiator tRNA by the bacterial factor IF2. A second part of my thesis work dealt with the factor eIF3, the most complex factor of the eukaryotic translation initiation apparatus. This multimeric factor, composed of 13 subunits in human and 5 in budding yeast, has no counterpart in the other kingdoms of life despite a central and essential role in Eukaryotes. In addition, eIF3 is involved in numerous cancers. However, the understanding of its functions is severely limited by the lack of structural information on subunits interactions and on interactions with other partners of the translation apparatus. This work led to the development of a plasmid library allowing the coexpression of Saccharomyces cerevisiae eIF3's subunits or stabilized forms of them in the Bacteria Escherichia coli. The purifications of the individual subunits and different subcomplexes are leading us on the road of the factor structure determination by an approach combining crystallography and electron microscopy.
Le démarrage de la traduction est un processus central dans toute cellule. L'étude des protéines assistant le ribosome pour réaliser cette étape, les facteurs de démarrage (Initiation Factors Ifs), permet d'obtenir des informations sur les mécanismes moléculaires complexes assurant la fidélité et l'efficacité du démarrage. La comparaison des jeux de facteurs protéiques dans les trois règnes du monde vivant a permis de mettre en évidence la présence de trois facteurs universellement conservés. Parmi ceux-ci, le facteur eucaryotique/archéen e/aIF5B, homologue au facteur bactérien IF2, stimule l'association des sous-unités ribosomales au même titre que chez les Bactéries. Néanmoins, l'universalité du facteur est limitée par l'absence d'interaction reportée entre le facteur e/aIF5B et l'ARNt initiateur alors que cette liaison est parfaitement caractérisée chez les Bactéries. Une partie de ce travail de thèse a permis d'étendre la similitude fonctionnelle entre les facteurs en mettant en évidence une liaison de l'ARNt initiateur méthionylé par le facteur e/aIF5B. Cette liaison présente des caractéristiques identiques à celle de l'ARNt initiateur méthionylé et formylé par le facteur bactérien IF2. Une deuxième partie du travail de thèse a concerné le facteur eIF3, le plus complexe du système de démarrage chez les Eucaryotes. Ce complexe de 13 sous-unités chez l'humain et de 5 sous-unités chez la levure n'a pas d'équivalent dans les autres domaines du vivant bien qu'il joue un rôle central et essentiel chez les Eucaryotes. La compréhension de ses fonctions est néanmoins fortement limitée par le manque d'information à l'échelle moléculaire sur les interactions entre les sous-unités le composant et avec ses autres facteurs partenaires. De plus, le facteur s'avère être impliqué dans de nombreux cancers, ce qui étend l'intérêt de son étude. Mon travail a permis de développer une bibliothèque de vecteurs permettant de coexprimer les différentes sous-unités ou des formes stabilisées des sous-unités du facteur eIF3 de levure chez la Bactérie Escherichia coli. La purification des sous-unités isolées et de différents sous-complexes nous permet d'envisager la résolution de la structure du facteur et de son organisation par une approche alliant la cristallographie et la microscopie électronique.