Mesure du métabolisme de la levure par flux osmotiques entre gouttes d'émulsion

Laurent Boitard

Résumé

Les travaux accomplis au cours de cette thèse au Laboratoire de Colloïdes et Matériaux Divisés résultent d'une volonté de développer et d'utiliser des outils physico-chimiques pour la compréhension de problématiques biologiques. Nous avons choisi comme objet d'étude ce champignon unicellulaire extraordinaire qu'est la levure Saccharomyces cerevisiae. En particulier nous nous sommes intéressés à la fermentation alcoolique à travers la mesure d'un des paramètres du métabolisme : l'énergie de maintenance. Les résultats obtenus s'articulent autour de deux réalisations principales. *** Développement d'un outil de mesure original : Nous avons mis au point un système physico-chimique qui permet de mesurer la polymérisation ou la dépolymérisation au sein de microréservoirs de quelques dizaines de picolitres . Le principe repose sur l'osmose, c'est-à-dire la di usion, à travers une membrane semi-perméable, de solvant entre des réservoirs qui possèdent des potentiels chimiques di érents. Pour réaliser ce système nous avons fabriqué un réseau de gouttes d'émulsion inverse qui constituent des microréservoirs dans lesquels nous avons encapsulé les levures. Les gouttes ont été organisées en un réseau bi-dimensionnel qui nous a permis de suivre des cinétiques de croissance sur un grand nombre d'échantillons (haut débit). Nous avons alors élaboré une nouvelle formulation de l'émulsion afin de rendre les gouttes adhésives entre elles. Ceci nous a permis d'imposer les dimensions et les propriétés de transport à l'intérieur des membranes semi-perméables ainsi formées entre les gouttes en contact. Nous avons alors démontré qu'en imposant des potentiels chimiques constants dans le réseau de gouttes, nous pouvions suivre, à travers l'évolution de leur volumes, la cinétique de processus de polymérisation (création de biomasse dans le cas de la levure) et de dépolymérisation (dans le cas de la lyse enzymatique) qui ont lieu dans des réservoirs. *** Mesure directe de l'énergie de maintenance : Nous avons utilisé notre outil pour mesurer la consommation du glucose par S. cerevisiae lors de la fermentation alcoolique en milieu anaérobie. Nous avons ainsi distingué deux comportements suivant que les cellules se divisent ou qu'elles sont en phase stationnaire. Nous avons développé un modèle qui nous a permis d'expliquer les comportements observés en fonction des paramètres expérimentaux (concentration en sucre, transport) et du métabolisme de la levure. Nous nous sommes alors rendu compte qu'en imposant le réactif limitant nous pouvions mesurer l'énergie de maintenance, c'est-à-dire l'énergie qui n'est pas utilisée pour la division cellulaire. Nous avons enfin mesuré le taux de consommation de glucose pour trois souches différentes. Nous avons ainsi montrer qu'il était possible d'identifier des souches selon leur capacité à métaboliser le glucose. Nous nous sommes alors interrogés sur la possibilité de cribler à haut débit des souches capables de métaboliser des sucres différents. Aussi, nous pouvons envisager, pour augmenter la taille de la librairie à trier, une approche 3D. Les gouttes sont collectées dans une seringue dans laquelle le mûrissement entre les gouttes se produit. Elles sont alors réinjectées dans un microsystème contenant une centaine de zones de tri. Avec un débit d'injection des gouttes de 10kHz, sachant qu'une goutte sur 10 contient une levure, on peut alors cribler une librairie de 108 individus différents en moins de 30 minutes. *** Au total : Le principe de mûrissement des gouttes développé dans cette thèse peut s'appliquer à tout processus qui se traduit par une modification du nombre d'espèces osmotiquement actives. On peut donc envisager de l'utiliser pour un champ vaste d'applications telle que la recherche de nouvelles enzymes de protéolyse. Enfin, nous aimerions attirer l'attention du lecteur sur l'aspect statistique de cette méthode. Elle offre la possibilité d'étudier des processus de sécrétion ou d'assimilation de plusieurs milliers d'individus isolés. Ainsi, des questions telles que la variabilité entre individus vont pouvoir être abordées.

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