NMR investigation of the structure and the action mechanism of viral site specific endoribonuclease RegB.
Etude de l'endoribonucléase de restriction RegB.
Résumé
The restriction endoribonuclease RegB from the bacteriophage T4 is involved in the transition between the early and the middle phase of the lytic cycle of the virus. RegB cleaves with an almost absolute specificity the GGAG sequence needed for the bacterial initiation of the translation. We characterized the toxicity level of RegB in the bacterium and presented new tools to bypass this problem. We also presented a biotechnological application of RegB for the design of a positive selection and dual expression vector. Using 31P NMR, we found that RegB acts as a transphosphorylase. Mutagenesis studies combined with the sequencing of the regB gene from the phage RB49 showed that the residues E19, H48 , R52 and H68 may be involved in the activity of RegB. The RegB H48A point mutant was chosen to build a structural model of the active site of RegB. The sequential assignment of the protein using 1H/15N/13C heteronuclear NMR was driven successfully.
L'endoribonucléase de restriction RegB est une enzyme produite par le bactériophage T4. Elle est impliquée dans la transition phase précoce-phase moyenne durant le cycle lytique du virus. RegB coupe avec une spécificité quasi absolue la séquence GGAG impliquée notamment dans l'initiation de la traduction chez la bactérie Escherichia coli. Nous avons caractérisé dans cette thèse de façon précise la toxicité de RegB dans la bactérie et nous avons proposé des outils pour contourner cette toxicité tels la manipulation du nombre de copies du vecteur d'expression ou l'atténuation de l'efficacité du site d'initiation de la traduction. Nous avons, par ailleurs, proposé une application de RegB pour la construction d'un vecteur de clonage à sélection positive et à expression duale dans les systèmes procaryotes et eucaryotes. L'étude par RMN du 31P de la cinétique de clivage d'un ARN par RegB a permis de définir RegB comme une "transphosphorylase libérant un phosphodiester 2', 3'-cyclique". Des études de mutagenèses dirigées et aléatoires combinées à l'évolution du gène regB dans un virus apparenté au phage T4 (le virus RB49) ont mis en évidence le rôle des résidus Glutamate 19, Histidine 48, Arginine 52 et Histidine 68 dans l'activité de RegB. Le mutant RegB H48A a été choisi pour construire un modèle structural du site actif de RegB. L'attribution séquentielle de cette protéine par RMN hétéronucléaire 1H/15N/13C a été entreprise avec succès.