b
c
	d

Figure 1. Structures des quinolones.

(a) Structure de base des quinolones et rôle des substituants ; A et B indiquent les cycles, les numéros indiquent la position des substituants (d’après [41]). (b) Structure de l’acide nalidixique, quinolone de première génération. (c) Structures de fluoroquinolones de deuxième génération utilisées dans cette étude. (d) Structure d’une fluoroquinolone de troisième génération.

Mycinose

Figure 2. Structure de deux macrolides naturels, l’érythromycine A, macrolide à 14 chaînons, et la tylosine, macrolide à 16 chaînons.

Tableau 1. Origine des macrolides naturels.

Macrolide	Nombre de chaînons	Organisme producteur
Erythromycine	14	Saccharopolyspora erythraea
Oléandomycine	14	Streptomyces antibioticus
Carbomycine	16	Streptomyces thermotolerans
Josamycine	16	Streptomyces narbonensis var. josamycetius nova sp
Midécamycine	16	Streptomyces mycarofaciens
Spiramycine	16	Streptomyces ambofaciens
Tylosine	16	Streptomyces fradiae

Figure 3. Structure d’un kétolide, la télithromycine.

Figure 4. Structure de la lincomycine et de son dérivé chloré, la clindamycine.

Figure 5. Structure des streptogramines B, pristinamycine IA et quinupristine, et des streptogramines A, pristinamycine IIA et dalfopristine.

Figure 6. Schéma du mode d’action des quinolones sur l’ADN gyrase, d’après [83].

(a) L’ADN gyrase et l’ADN interagissent et forment un complexe de clivage. (b) Effet bactériostatique des quinolones qui piègent le complexe de clivage de manière réversible, sauf lorsque l’ADN gyrase présente des mutations. (c) Libération irréversible de fragments d’ADN coupés à partir des complexes de clivage, faisant intervenir un facteur protéique non déterminé (voie sensible au chloramphénicol), entraînant la mort cellulaire. (d) Dissociation irréversible des sous-unités de l’ADN gyrase sous l’action des quinolones et libération de fragments d’ADN coupés (voie non sensible au chloramphénicol).

Figure 7. Structure secondaire de l’ARNr 23S (d’après [18]).

Les hélices sont numérotées selon Leffers et al. [198]. La boucle centrale du domaine V et l’épingle 35 du domaine II, impliquées dans la liaison des macrolides, sont désignées par des flèches.

Figure 8. Structure de la sous-unité 50S du ribosome de Deinococcus radiodurans complexée à l’érythromycine [375].

L’antibiotique, en rouge, est fixé dans le tunnel de sortie des polypeptides. Les protéines ribosomiques sont en jaune, l’ARNr 23S est en bleu foncé et l’ARNr 5S est en bleu clair.

Figure 9. Le tunnel de sortie des polypeptides (d’après [290]).

(A) La sous-unité 50S a été coupée en deux dans la longueur du tunnel et ouverte comme un livre. L’ARNr est en bleu clair; les protéines sont en vert. PT, centre peptidyltransférase. (B) Localisation des domaines de l’ARNr 23S et des protéines ribosomiques (L) autour du tunnel.

Figure 10. Représentation schématique de la paroi des bactéries à Gram positif, des bactéries à Gram négatif et des mycobactéries [151].

Figure 11. Représentation schématique de la membrane externe de la paroi des bactéries à Gram négatif [151].

Figure 12. Représentation schématique des différents systèmes d’efflux actif, d’après [319].

ATB, antibiotique substrat.

Figure 13. Organisation modulaire des protéines ABC.

Distinction entre les protéines ABC bactériennes, formées de plusieurs protéines (une couleur par protéine) et leurs homologues eucaryotes où généralement une protéine constitue le transporteur complet. Les flèches rouges indiquent la direction du transport ; dans le cas des systèmes d’import bactériens, la protéine extracellulaire liant le substrat est figurée en gris.

Figure 14. Organisation structurale des transporteurs ABC.

Les deux domaines transmembranaires (TMD) sont chacun constitué de 6 hélices a membranaires. Les domaines de fixation des nucléotides (NDB) sont situés du côté cytoplasmique de la membrane et contiennent les motifs conservés impliqués dans l’hydrolyse de l’ATP (motifs Walker A et Walker B, motif Signature). Les résidus les plus conservés de ces motifs sont indiqués.

Figure 15. Représentation schématique des motifs conservés d’un domaine liant les nucléotides.

Tableau 2. Protéines de la famille ABC cristallisées.

Nom		Organisme	Fonction	Résolution (Å)	Références	Cristaux obtenus
Domaines liant les nucléotides isolés
CFTR	Souris		Canal Cl^-	2,2 à 2,55	[199]	Sans nucléotide, avec ADP, avec ATP
CysA	A. acidocaldarius		Import des sulfates (supposé)	2,0	[374]	Sans nucléotide
GlcV	S. solfataricus		Import du glucose	1,65 à 2,1	[421]	Sans nucléotide, avec ADP-Mg^2+, avec AMP-PNP- Mg^2+
HisP	S. typhimurium		Import de l’histidine	1,5	[145]	Avec ATP
HlyB	E. coli		Export de l’hémolysine	2,6	[377]	Sans nucléotide
MalK	T. litoralis		Import du maltose	1,9	[78]	Avec pyrophosphate
MalK	E. coli		Import du maltose	2,6 à 2,9	[54]	Sans nucléotide et avec ATP
MJ0796	M. jannaschii		?	2,7	[450]	Avec ADP-Mg^2+
mutant E171Q				1,9	[389]	Avec ATP-Na^+
MJ1267	M. jannaschii		Transport des acides aminés Leu, Ile, Val (supposé)	1,6	[170]	Sans nucléotide et avec ADP-Mg^2+
RbsA	E. coli		Import du ribose	2,5	[14]
TAP1	H. sapiens		Présentation de l’antigène	2,4	[102]	Avec ADP-Mg^2+
Transporteurs ABC complets
BtuCD	E. coli		Import de la vitamine B12	3,2	[214]
MsbA	E. coli		Export du lipide A et du LPS	4,5	[51]
	V. cholera			3,8	[50]
	S. typhimurium			4,2	[345]	Avec Mg-ADP-Vi et LPS
Autres protéines ABC
MutS	E. coli		Réparation de l’ADN	2,2	[192, 301]
SMC	T. maritima		Maintenance structurale des chromosomes	3,1	[222]
						(à suivre)
Tableau 2. Protéines de la famille ABC cristallisées. (suite)
Nom	Organisme		Fonction	Résolution (Å)	Références	Cristaux obtenus
Rad50	P. furiosus		Réparation de l’ADN double brin	1,6 à 2,6	[137]	Sans nucléotide, avec ATP, avec AMP-PNP- Mg^2+
mutant S179R				2,1	[260]
RLI	P. furiosus		Biogénèse du ribosome, formation du complexe de translation…	1,9	[168]	Avec Mg^2+-ADP

AMP-PNP, Adénosine 5’(b-g-imido) triphosphate, LPS, lipopolysaccharide ; Vi, vanadate inorganique.

Figure 16. Structure du domaine liant les nucléotides HisP en présence d’ATP [145].

Les hélices a sont représentées en jaune, les feuilles b en vert, la molécule d’ATP est représentée en rouge.

Figure 17. Représentation des différentes orientations relatives des domaines liant les nucléotides des protéines ABC.

(1) Structures cristallographiques de dimères de NBD de HisP (a), Rad50 (b) et MalK (c). L’ATP est figuré en bâtons rouges. (2) Schémas des orientations relatives des NBD des protéines ABC HisP, MalK, Rad50 et de l’ATPase ArsA, d’après [175]. S indique le motif Signature et P le motif Walker A.

Figure 18. Représentation schématique des interactions entre ATP-Mg²⁺ et les résidus du domaine liant les nucléotides de HlyB [451].

Les résidus des motifs Walker A (en rouge) et Walker B (en rose), ainsi que de la D-loop (en noir) et de la Q-loop (en marron) appartiennent à un domaine liant les nucléotides (site cis) alors les résidus du motif Signature (en bleu) appartiennent à l’autre domaine liant les nucléotides du dimère de HlyB (site trans).

Figure 19. Cycle catalytique d’un transporteur ABC d’après [129], cas d’un système d’export.

Etape 1 : le cycle de transport débute avec la liaison du substrat au niveau des TMD, un changement de conformation est transmis aux NBD, ce qui facilite la liaison des deux molécules d’ATP et diminue l’énergie de formation du dimère fermé.

Etape 2 : la liaison des deux molécules d’ATP entraîne la formation du dimère fermé et une diminution de l’affinité du site de liaison du substrat [129, 353]. Il est supposé que le substrat est relâché à cette étape.

Etape 3 : l’ATP est hydrolysé, cette hydrolyse semble initier le retour du transporteur à son état initial, avec un dimère ouvert, en déstabilisant le dimère fermé par des répulsions électrostatiques.

Etape 4 : libération de phosphate inorganique puis d’ADP et retour à une conformation ouverte du dimère.

Figure 20. Représentation en ruban du système d’import de la vitamine B12 de E. coli, d’après [213].

Le transporteur ABC complet BtuCD est composé de quatre sous-unités : deux NBD, BtuD, en vert et bleu, et deux domaines transmembranaires, BtuC, en rouge et jaune [214]. Deux molécules de cyclotétravanadate occupent les sites de liaison des nucléotides des deux NBD. L’orientation relative de BtuCD et BtuF, la protéine extracellulaire liant la vitamine B12 [34], faite manuellement, positionne les résidus conservés de BtuC et BtuF en face-à-face, et la molécule de vitamine B12 se situe ainsi au niveau de l’ouverture du canal formé par BtuC [213].

Figure 21. Modèle proposé pour le transport du lipopolysaccharide par MsbA [345].

Les domaines liant les nucléotides de MsbA ne sont pas représentés. (A) Le lipopolysaccharide (LPS) se lie à l’hélice elbow (structure fermée). (B) Les têtes lipidiques du LPS s’insèrent dans la chambre formée par les hélices membranaires. (C) La protéine subit des changements de conformation suite à la liaison et l’hydrolyse de l’ATP. (D) Le LPS est situé au niveau de la membrane externe, comme observé dans la structure de MsbA de S. typhimurium.

Tableau 3. Transporteurs ABC impliqués dans la résistance spécifique aux antibiotiques.

Transporteur	Organisme	Substrats	Références
Organismes producteurs
Ard1	S. capreolus	A201A	[20]
AviABC1 - AviABC2	S. viridochromogenes	Avilamycine	[435]
BcrABC	B. licheniformis	Bacitracine	[321]
Car(A)	S. thermotolerans	Carbomycine (M16)	[381]
DrrAB	S. peuceticus	Anthracyclines	[171]
Ert(X)	S. erythraea	Erythromycine ? (M14)	[299]
LmrB	L. lactis	Bactériocines	[97]
Lmr(C)	S. lincolnensis	Lincomycine (L)	[317]
Ole(B)	S. antibioticus	Oléandomycine (M14)	[296]
Ole(C) – Ole(C5)	S. antibioticus	Oléandomycine (M14)	[351]
Srm(B)	S. ambofaciens	Spiramycine (M16)	[381]
Tlr(C)	S. fradiae	Tylosine (M16)	[359]
TnrB	S. longisporoflavus	Tétronasine	[209]
Var(M)	S. virginiae	Virginiamycine (S)	[172]
Organismes non producteurs
BcrAB	E. faecalis	Bacitracine	[233]
DrrAB	M. tuberculosis	Anthracyclines	[64]
Lsa	E. faecalis	L, SA	[388]
MacB	E. coli	M14-15	[182]
Msr(A)	S. epidermidis	M14-15,SB	[357]
Msr(C)	E. faecium	M, SB	[386]
Msr(D)	Streptococcus spp.	M14-15-16	[74]
Rv2686c - Rv2687c - Rv2688c	M. tuberculosis	Fluoroquinolones	[306]
Vga(A)	S. aureus	L, SA	[9, 56]
Vga(B)	S. aureus	S	[8, 56]

L, lincosamides ; M₁₄, M₁₅, M₁₆, macrolides à 14, 15 et 16 chaînons ; S_A, S_B, streptogramines A et B ; ?, transporteur supposé.

Tableau 4. Transporteurs ABC conférant une résistance de type MDR.

Transporteur	Organisme	Substrats	Références
BmrA	B. subtilis	EtBr, H33342, doxorubicine, 7-aminoactinomycin D	[390]
EfrAB	E. faecalis	CIP, NOR, doxycycline, anthracyclines, ACR, DAPI, TPP^+	[197]
HorA	L. brevis	Iso-a-acids, novobiocine, EtBr, H33342	[366]
LmrA	L. lactis	AM, C, FQ, MLS, TC, vinca alkaloids, anthracyclines, colchicine, EtBr, valinomycine, nigéricine, H33342	[417]
Md1-Md2	M. hominis	CIP, NOR, ACR, EtBr	[338]
Msr	S. rochei F20	M, TC, doxorubicine	[90]
VcaM	V. cholerae non-O1	CIP, NOR, TC, anthracyclines, DAPI, H33342	[144]
YdaG-YdbA	L. lactis	EtBr, daunomycine	[223]

ACR, acriflavine ; AM, aminoglycosides ; C, chloramphénicol ; CIP, ciprofloxacine ; DAPI, 4’,6-diamidino-2-phénylindole ; EtBr, bromure d’éthidium ; FQ, fluoroquinolones ; H3342, Hoechst 33342 ; MLS, macrolides, lincosamides et streptogramines ; NOR, norfloxacine ; S,; TC, tétracyclines ; TPP⁺: ion tétraphénylphosphonium.

A

B

Figure 22. Représentation schématique des transporteurs de la famille MFS.

En (A), un transporteur à 12 segments transmembranaires et en (B) un transporteur à 14 TMS, d’après [336].

Tableau 5. Pompes d’efflux de la famille MFS conférant une résistance spécifique.

	Transporteur	Organisme	Substrats	Références
à 12 TMS
	Bcr	E. coli	Sulfonamide	[26]
	CmlA	P. aeruginosa	C	[28]
	CmlA2	E. aerogenes	C	[320]
	Flo	S. typhimurium, E. coli	C, florfénicol	[33, 437]
	LmrA	S. lincolnensis	Lincomycine	[452]
	Mef(A)	Streptocoques	M14-15	[396]
	Ptr	S. pristinaespiralis	Pristinamycine	[29]
	Tap	M. tuberculosis	TC	[5]
	TetA-TetE, TetG, TetH , TetI, TetJ, TetZ	Bactéries à Gram-négatif	TC	[63]
	TetV	Mycobactéries	TC	[426]
à 14 TMS
	TetK, TetL	Bactéries à Gram-positif	TC	[63]
	VarS	S. virginiae	Virginiamycine S	[196]

C, chloramphénicol ; M_14-15, macrolides à 14 et 15 chaînons ; TC, tétracyclines.

Tableau 6. Pompes d’efflux MDR de la famille MFS.

Transporteur		Organisme	Substrats	Références
à 12 TMS
	Blt	B. subtilis	FQ, doxorubicine, EtBr, ACR, R6G, TPP^+, spermidine	[4, 440]
	Bmr	B. subtilis	C, FQ, doxorubicin, puromycin, EtBr, ACR, R6G, TPP^+	[279, 282]
	Cme	C. difficile	ERY, EtBr, safranine O	[193]
	Cmr	C. glutamicum	ERY, TC, puromycine, bléomycine	[150]
	EmeA	E. faecalis	NOR, EtBr	[154]
	EmrD	E. coli	CCCP, salicylate	[289]
	Lde	L. monocytogenes	FQ, EtBr, ACR	[111]
	LmrP	L. lactis	MLS, TC, daunomycine, EtBr, H33342, R123, TPP^+	[322]
	MdfA (Cmr, CmlA)	E. coli	certains AM, C, ERY, FQ, TC, daunomycine, rifampicine, puromycine, EtBr, R6G, BZC, TPP^+	[85]
	MdrL	L. monocytogenes	M, céfotaxime, EtBr, métaux lourds	[244]
	MdtA	L. lactis	MLS, TC	[316]
	NorA	S. aureus	FQ hydrophiles, EtBr, ACR, CET, TPP^+, BZC	[166, 283]
	NorB	S. aureus	FQ, EtBr, CET	[406]
	PmrA	S. pneumoniae	FQ hydrophiles, EtBr, ACR	[109]
	Tap	M. fortuitum	AM, TC	[5]
à 14 TMS
	BcrA	B. cepacia	NAL, TC	[438]
	Bmr3	B. subtilis	FQ, ACR, EtBr, TPP^+	[293]
	EfpA	M. smegmatis	FQ, AQ	[204]
	EmrB	E. coli	NAL, CCCP, thiolactomycine, tetrachlorosalicylanilide	[217]
	LfrA	M. smegmatis	FQ hydrophiles, EtBr, ACR, certains AQ	[210, 399]
	MdeA	S. aureus	Virginiamycine, novobiocine, EtBr, BZC	[140]
	P55	M. tuberculosis, M. bovis	AM, TC	[385]
	QacA	S. aureus	AQ mono- et divalents, chlorhexidine, CV, EtBr, R6G	[256]
	QacB	S. aureus	AQ monovalent, chlorhexidine, CV, EtBr, R6G	[310]
	Rv1877	M. smegmatis	ERY, TC, kanamycine, AQ	[204]
	VceB	V. cholerae	M, NAL, FQ hydrophobes, CCCP	[70]

ACR, acriflavine ; AM, aminoglycosides ; AQ, ammoniums quaternaires ; BZC, chlorure de benzalkonium ; C, chloramphénicol ; CCCP, chlorophénylhydrazone du mésoxazolonitrile ; CET: cétrimide ; CV, cristal violet ; ERY, érythromycine ; EtBr, bromure d’éthidium ; FQ, fluoroquinolones ; H33342, Hoechst 33342 ; M, macrolides ; MLS, macrolides-lincosamides-streptogramines ; NAL, acide nalidixique ; NOR, norfloxacine ; R123, rhodamine 123 ; R6G, rhodamine 6G ; TC, tétracyclines ; TPP⁺, bromure de tétraphénylphosphonium.

Figure 23 FIGURE Glp
Tableau 7. Systèmes d’efflux de la famille RND.

Transporteur	Organisme	MFP	OMF	Substrats	Références
AcrB	E. aerogenes	AcrA	TolC	CIP, NOR, C, M, TC, ACR, SDS, sels biliaires	[331]
AcrB	E. coli	AcrA	TolC	b-lactames, C, M, FQ, NAL, TC, RP, novobiocine, triclosan, EtBr, sels biliaires	[295]
AcrB	H. influenzae	AcrA		ERY, RP, novobiocine, EtBr, CV	[367]
AcrB	Klebsiella spp.	AcrA		CIP	[247]
AcrB	S. typhimurium	AcrA	TolC	FQ	[288]
AcrD	E. coli			AM	[352]
AcrF	E. coli	AcrE	TolC	b-lactames, C, M, NAL, FQ, TC, RP, novobiocine, triclosan, EtBr, sels biliaires	[289]
AdeB	A. baumannii	AdeA	AdeC	FQ	[228]
AmrB	B. pseudomallei	AmrA	OprA	AM, M	[262]
ArpB	P. putida	ArpA	ArpC	TC, C, carbenicilline, streptomycine, ERY, novobiocine	[176]
BmeB	B. fragilis	BmeA	BmeC	Certains céphèmes, peptides antimicrobiens, acide fusidique, novobiocine, puromycine	[411]
BpeB	B. pseudomallei	BpeA	OprB	Gentamicine, streptomycine, ERY, ACR	[49]
CeoB	B. cenocepacia	CeoA	OpcM	CIP, C, TM, salicylate	[270]
CmeB	C. jejuni	CmeA	CmeC	b-lactames, FQ, ERY, C, RP, TC, EtBr, acridine orange, SDS, sels biliaires	[207, 333]
EefB	E. aerogenes	EefA	EefC	C, CIP, NOR, ERY, TC, doxycycline	[243]
EmhB	P. fluorescens	EmhA	EmhC	C, NAL	[125]
MdtB-MdtC	E. coli	MdtA	TolC	novobiocine, sels biliaires, SDS	[269]
HefB	H. pylori	HefA	HefC	ERY, clindamycine, TC, pénicilline G, EtBr, novobiocine	[190]
MexB	P. aeruginosa	MexA	OprM	b-lactames, C, M, FQ, NAL, TC, RP, TM, novobiocine, SDS, CV, EtBr	[329]
MexD	P. aeruginosa	MexC	OprJ	b-lactames, C, M, FQ, TC, TM, CV, EtBr	[328]
MexF	P. aeruginosa	MexE	OprN	C, FQ, imipénèm, TM	[183]
MexI	P. aeruginosa	MexH	OpmD	NOR, EtBr, ACR, R6G	[383]
MexK	P. aeruginosa	MexJ	OprM	TC, ERY, triclosan	[65]
MexW	P. aeruginosa	MexV	OprM	FQ, TC, C, ERY, EtBr, ACR	[206]
MexY	P. aeruginosa	MexX	OprM	AM, EtBr	[255]
MtrD	N. gonnorhoeae	MtrC	MtrE	CIP, M, TC, peptides antimicrobiens, sels biliaires	[116, 384]
SdeB	S. marcescens	SdeA		FQ, C, EtBr, SDS	[189]
SdeY	S. marcescens	SdeX		ERY, TC, NOR, BZC, EtBr, ACR, R6G	[53]
SmeB	S. maltophilia	SmeA	SmeC	AM, FQ	[205]
SmeE	S. maltophilia	SmeD	SmeF	TC, C, ERY, quinolones, EtBr	[10]
TbtB	P. stutzeri	TbtA	TbtM	Tributyltine, C, NAL, sulfaméthoxazole	[155]
TtgB	P. putida	TtgA	TtgC	C, NAL, TC, ampicilline	[401]
XepB	P. gingivalis	XepA	XepC	RP, puromycine, EtBr, SDS	[147]
YerP	B. subtilis	-	-	Surfactine, EtBr, ACR	[409]
YhiV	E. coli	YhiU	TolC	ERY, doxorubicine, déoxycholate, CV, EtBr, R6G	[289]

ACR, acriflavine ; AM, aminoglycosides ; BZC, chlorure de benzalkonium ; C, chloramphénicol ; CIP, ciprofloxacine ; CV, cristal violet ; ERY, érythromycine ; EtBr, bromure d’éthidium ; FQ, fluoroquinolones ; M, macrolides ; NAL, acide nalidixique ; NOR, norfloxacine ; R6G, rhodamine 6G ; RP, rifampicine ; SDS, sel de sodium de l’acide dodécyl sulfonique ; TC, tetracyclines ; TM, triméthoprime.

Figure 24. Représentation schématique d’un transporteur de la famille RND, d’après [336].

Figure 25. Modèle proposé pour le complexe AcrB-TolC par Murakami et al. [267].

Les trois monomères de AcrB sont en bleu, vert et rose ; les trois monomères de TolC sont en rouge, orange foncé et orange clair.

Tableau 8. Systèmes d’efflux de la famille MATE.

Transporteur	Organisme	Substrats	Références
BexA	B. thetaiotaomicron	CIP, NOR, EtBr	[257]
CdeA	C. difficile	FQ, EtBr, ACR	[82]
HmrM	H. influenzae	NOR, DAPI, anthracyclines, EtBr, TPP^+, H33342, berbérine	[443]
MepA	S. aureus	Tigécycline, NOR, EtBr, TPP^+, DAPI	[156, 248]
NorE (YdhE)	E. coli	CIP, NOR, TPP^+	[263, 445]
NorM	V. parahaemolyticus	CIP, NOR, kanamycine, streptomycine, EtBr	[40, 263]
NorM	Neisseria spp.	ACR, EtBr, berbérine	[361]
PmpM	P. aeruginosa	FQ, ACR, BZC, EtBr, TPP^+	[124]
VcmA	V. cholerae non-O1	FQ, anthracyclines, streptomycine, kanamycine, EtBr, DAPI, H33342, ACR	[143]
VcrM	V. cholerae non-O1	ACR, DAPI, H33342, R6G, EtBr, TPP^+	[142]
VmrA	V. parahaemolyticus	ACR, DAPI, EtBr, TPP^+	[55]

ACR, acriflavine ; BZC, chlorure de benzalkonium ; CIP, ciprofloxacine ; DAPI, 4’,6-diamidino-2-phénylindole ; EtBr, bromure d’éthidium ; FQ, fluoroquinolones ; H33342, Hoechst 33342 ; NOR, norfloxacine ; QAC, ammoniums quaternaires ; R6G, rhodamine 6G ; TPP⁺, bromure de tétraphénylphosphonium.

Tableau 9. Systèmes d’efflux de la famille SMR.

Transporteur	Organisme	Substrats	Références
EbrA-EbrB	B. subtilis	EtBr, ACR, pyronine Y, safranine O	[242]
EmrE	E. coli	EtBr, ACR	[446]
EmrE	P. aeruginosa	EtBr, ACR, AM hydrophiles	[203]
Mmr	M. tuberculosis	ERY, EtBr, ACR, TPP^+, pyronine Y, safranine O	[77]
QacE	Bactéries à Gram-négatif	Sulfonamides, EtBr, AQ	[188]
QacEΔ1	Bactéries à Gram-négatif	Sulfonamides, CIP, gentamicine, TC, EtBr, AQ	[188]
QacG	Staphylococcus spp.	EtBr, AQ	[126]
QacH	S. saprophyticus	EtBr, AQ	[126]
Smr (QacC/Ebr/QacD)	S. aureus	EtBr, AQ, TPP^+	[308]
YkkC-YkkD	B. subtilis	C, TC, streptomycine, EtBr, TPP^+, pyronine Y	[148]

ACR, acriflavine ; AM, aminoglycosides ; AQ, ammoniums quaternaires ; C, chloramphénicol ; CIP, ciprofloxacine ; ERY, érythromycine ; EtBr, bromure d’éthidium ; TC, tétracyclines ; TPP⁺, bromure de tétraphénylphosphonium.

Figure 26. Représentation schématique d’un transporteur de la famille SMR, d’après [336].

Figure 27. Représentation en ruban de EmrE [227].

Quatre protéines EmrE (en bordeaux, gris, bleu et vert) forment un tétramère : le système de transport est composé de deux hétérodimères, chacun contenant deux protéine EmrE de conformations différentes. Le résidu Glu14 (TMS 1) est représenté en sphères rouges. N, extrémité N-terminale, C, extrémité C-terminale.

Vers TolC

Figure 28. Coupe de la structure de AcrB d’après [218].

La cavité centrale du transporteur située à la base du périplasme est accessible aux substrats à partir du cytoplasme et depuis le périplasme ; les substrats sont ensuite efflués vers TolC.

Tableau 10. Pompes d’efflux touchant les fluoroquinolones.

Organisme	Pompe	Substrats	Famille	Spécificité	Références
Bactéries à Gram positif
B. subtilis	Blt	FQ	MFS	MDR	[4, 440]
	Bmr	FQ	MFS	MDR	[279, 282]
	Bmr3	FQ	MFS	MDR	[293]
E. faecalis	EfrAB	CIP, NOR	ABC	MDR	[197]
	EmeA	NOR	MFS	MDR	[154]
L. lactis	LmrA	FQ	ABC	MDR	[417]
L. monocytogenes	Lde	FQ	MFS	MDR	[111]
S. aureus	NorA	FQ hydrophiles	MFS	MDR	[166, 283]
S. pneumoniae	PmrA	FQ hydrophiles	MFS	MDR	[109]
Bactéries à Gram négatif
A. baumannii	AdeB	FQ	RND	MDR	[228]
B. cenocepacia	CeoB	CIP	RND	MDR	[270]
B. thetaiotaomicron	BexA	CIP, NOR	MATE	MDR	[257]
C. difficile	CdeA	FQ	MATE	MDR	[82]
C. jejuni	CmeB	FQ	RND	MDR	[207, 333]
E. aerogenes	AcrB	CIP, NOR,	RND	MDR	[331]
E. coli	MdfA (Cmr, CmlA)	FQ	MFS	MDR	[85]
	AcrB	FQ	RND	MDR	[295]
	AcrF	FQ	RND	MDR	[289]
	NorE (YdhE)	CIP, NOR	MATE	MDR	[263, 445]
H. influenzae	HmrM	NOR	MATE	MDR	[443]
Klebsiella spp.	AcrB	CIP	RND	MDR	[247]
N. gonnorhoeae	MtrD	CIP	RND	MDR	[116]
P. aeruginosa	MexB	FQ	RND	MDR	[329]
	MexD	FQ	RND	MDR	[328]
	MexF	FQ	RND	MDR	[183]
	MexI	NOR	RND	MDR	[383]
	MexW	FQ	RND	MDR	[206]
	PmpM	FQ	MATE	MDR	[124]
S. maltophilia	SmeB	FQ	RND	MDR	[205]
	SmeE	quinolones	RND	MDR	[10]
S. marcescens	SdeY	NOR	RND	MDR	[53]
S. typhimurium	AcrB	FQ	RND	MDR	[288]
V. cholerae	VceB	FQ hydrophobes	MFS	MDR	[70]
V. cholerae non-O1	VcaM	CIP, NOR	ABC	MDR	[144]
	VcmA	FQ	MATE	MDR	[143]
V. parahaemolyticus	NorM	CIP, NOR	MATE	MDR	[40, 263]
Bactéries à Gram positif et négatif	QacEΔ1	CIP	SMR	MDR	[188]
Mycobactéries
M. tuberculosis	Rv2686c - Rv2687c - Rv2688c	FQ	ABC	Spécifique	[306]
M. smegmatis	EfpA	FQ	MFS	MDR	[204]
	LfrA	FQ hydrophiles	MFS	MDR	[210, 399]
Mycoplasmes
M. hominis	Md1-Md2	CIP, NOR	ABC	MDR	[338]

Tableau 11. Pompes d’efflux touchant les macrolides, lincosamides et streptogramines chez les organismes producteurs.

Organisme	Transporteur	Antibiotique	Famille	Références
S. thermotolerans	Car(A)	Carbomycine (M16)	ABC II	[381]
S. erythraea	Ert(X)	Erythromycine ? (M14)	ABC II	[299]
S. antibioticus	Ole(B)	Oléandomycine (M14)	ABC II	[296]
	OleC – OleC5		ABC I	[351]
S. ambofaciens	Srm(B)	Spiramycine (M16)	ABC II	[381]
S. fradiae	Tlr(C)	Tylosine (M16)	ABC II	[359]
S. lincolnensis	Lmr(C)	Lincomycine (L)	ABC II	[317]
	Lmr(A)		MFS	[452]
S. pristinaespiralis	Ptr	Pristinamycine (S)	MFS	[29]
S. virginiae	Var(M)	Virginiamycine (S)	ABC II	[172]
	Var(S)	Virginiamycine S (SB)	MFS	[196]

M₁₄, M₁₆, macrolides à 14 et 16 chaînons ; L, lincosamides ; S, streptogramines ; S_B, streptogramines B ; ABC I, ABC II, transporteur ABC de type I ou II ; MFS, transporteur de la famille MFS ; ?, transporteur supposé. 

Figure 29. Arbre phylogénétique simplifié des protéines ABC de type II, d’après [347].

Orf5 réfère à Msr(D) ; la protéine UvrA (E. coli) impliquée dans la réparation de l’ADN a été incluse pour comparaison.

Tableau 12. Autres pompes d’efflux touchant les macrolide, lincosamides et streptogramines.

Organisme	Pompe	Substrats	Famille	Spécificité	Références
Bactéries à Gram positif
E. faecalis	Lsa	L, SA	ABC II	Spécifique	[388]
E. faecium	Msr(C)	M, SB	ABC II	Spécifique	[386]
L. lactis	LmrP	MLS	MFS	MDR	[322]
L. lactis	MdtA	MLS	MFS	MDR	[316]
L. monocytogenes	MdrL	M	MFS	MDR	[244]
S. aureus	MdeA	S	MFS	MDR	[140]
S. aureus	Vga(A)	L, SA	ABC II	Spécifique	[9]
S. aureus	Vga(B)	S	ABC II	Spécifique	[8]
S. epidermidis	Msr(A)	M14-15,SB	ABC II	Spécifique	[357]
Streptococcus spp.	Mef(A)	M14-15	MFS	Spécifique	[396]
Streptococcus spp.	Msr(D)	M14-15-16	ABC II	Spécifique	[74]
S. rochei F20	Msr	M	ABC	MDR	[90]
Bactéries à Gram négatif
B. pseudomallei	AmrB	M	RND	MDR	[262]
B. pseudomallei	BpeB	ERY	RND	MDR	[49]
C. glutamicum	Cmr	ERY	MFS	MDR	[150]
C. jejuni	CmeB	ERY	RND	MDR	[207, 333]
E. aerogenes	AcrB	M	RND	MDR	[331]
E. coli	AcrB	M	RND	MDR	[295]
E. coli	AcrF	M	RND	MDR	[289]
E. coli	MacB	M14-15	ABC	Spécifique	[182]
E. coli	MdfA (Cmr, CmlA)	ERY	MFS	MDR	[85]
E. coli	YhiV	ERY	RND	MDR	[289]
H. influenzae	AcrB	ERY	RND	MDR	[367]
N. gonnorhoeae	MtrD	M	RND	MDR	[116]
P. aeruginosa	MexB	M	RND	MDR	[329]
P. aeruginosa	MexD	M	RND	MDR	[328]
P. aeruginosa	MexK	ERY	RND	MDR	[65]
P. aeruginosa	MexW	ERY	RND	MDR	[206]
P. putida	ArpB	ERY	RND	MDR	[176]
S. maltophilia	SmeE	ERY	RND	MDR	[10]
S. marcescens	SdeY	ERY	RND	MDR	[53]
V. cholerae	VceB	M	MFS	MDR	[70]
Mycobactéries
M. smegmatis	Rv1877	ERY	MFS	MDR	[204]
M. tuberculosis	Mmr	ERY	SMR	MDR	[77]

ABC II, transporteur ABC de type II ; ERY, érythromycine (M₁₄) ; M₁₄, M₁₅, M₁₆, macrolides à 14, 15 et 16 chaînons ; L, lincosamides ; S_A, S_B, streptogramines de type A et B.

Figure 30. Structures d’une tétracycline, la doxycycline, et d’un dérivé 13-thio de la tétracycline, le 13-cyclopentylthio-tétracycline, qui est un inhibiteur de la pompe d’efflux Tet(B).

Figure 31. Inhibiteurs connus des systèmes d’efflux eucaryotes.

Figure 32. Structures des inhibiteurs les plus efficaces de la pompe NorA identifiés par Markham et al. [240].

Figure 33. Structures d’une phénothiazine, la chlorpromazine, et de deux phénylpipéridines inhibiteurs sélectifs de la capture de la sérotonine, le paroxétine (actif) et le fémoxétine (inactif).

Figure 34. Structures d’inhibiteurs naturels de la pompe NorA.

Figure 35. Structures d’inhibiteurs de pompes d’efflux de la famille RND.

Un criblage de composés synthétiques a permis d’identifier le dipeptide amide, PAbN (1), comme IPE de pompes RND. A partir de ce squelette peptidique, des efforts pour améliorer sa stabilité aux protéases ont conduit à (2) qui a deux acides aminés D. La synthèse d’analogues a abouti à la molécule (3) qui est moins toxique que (4).

D’autres molécules, qui ne contiennent pas ce squelette peptidique, telles le benzimidazole (5) ou l’arylpipérazine (6), peuvent aussi agir comme IPE de systèmes RND.

Figure 36. Structures de quinolines utilisées comme inhibiteurs des systèmes RND.

Partant d’une pyridoquinoline (6), la synthèse d’analogues a montré que des composés 4-substitués, comme des thioalkyl- (7), alkylamino- (8) et alkoxy-quinolines (9) sont des inhibiteurs efficaces des transporteurs RND.

Figure 37. Conception rationnelle et amélioration d’inhibiteurs spécifiques du système MexAB-OprM de P. aeruginosa.

Partant de la molécule tête de série (10), les caractéristiques clés pour l’inhibition des pompes d’efflux ont été identifiées. Ceci a permis la conception de (11), bâtie sur un squelette pyridopyrimidine qui respecte ces critères et qui a de meilleures propriétés physico-chimiques que (10). Grâce à des études de relation structure-activité, ce squelette a encore été optimisé, conduisant au puissant IPE (12). Comme cette molécule est peu stable, des modifications chimiques supplémentaires ont été apportées, aboutissant à la molécule (13).

Figure 38. Inhibiteurs des pompes d’efflux de type ABC.

Figure 39. Structures de substrats de la pompe d’efflux NorA.

Figure 40. Structures d’inhibiteurs de pompes d’efflux utilisés dans cette étude.

Figure 41. Robot Biomek 2000 installé au laboratoire.

Tableau 13. Composition du milieu de conservation des souches.

	Pour 200 ml de milieu
Infusion de cœur cervelle	7,4 g
Glycérol	30 ml
Eau distillée q.s.p.	170 ml

Après mélange, le milieu est stérilisé 15 min à 120°C, puis réparti en tubes de 1 ml.

Tableau 14. Composition du milieu de Mueller Hinton (MH)^a.

	Pour 1 litre de milieu
Infusion de viande de boeuf	300 ml
Hydrolysat de caséine	17,5 g
Amidon	1,5 g
Eau distillée q.s.p.	1000 ml
pH	7,3 ± 0,1

^a La composition des milieux gélosés est identique à part la présence d’agar purifié à 10 g/l.

Tableau 15. Composition du milieu de Luria-Bertani (LB).

	Pour 1 litre de milieu
Bacto-Tryptone	10 g
Extrait de levure	5 g
NaCl	10 g
Eau distillée q.s.p.	1000 ml
pH (ajusté avec NaOH)	7

Tableau 16. Composition du milieu M17^a.

	Pour 1 litre de milieu
Digestion pancréatique de caséine	5,0 g
Peptone de soja	5,0 g
Extrait de bœuf	5,0 g
Extrait de levure	2,5 g
Acide ascorbique	0,5 g
Sulfate de magnésium	0,25 g
β-glycérophosphate disodique	19,0 g
pH	6,9 ± 0,2
Eau distillée q.s.p.	950 ml
Lactose à 10%	50 ml

^a La composition des milieux gélosés est identique à part la présence d’agar purifié à 10 g/l.

Figure 42. Représentation schématique du vecteur plasmidique pBAD/Myc-HisA (Invitrogen).

colE1, origine de réplication de E. coli ; araC, gène codant la protéine régulatrice AraC ; p_BAD, promoteur de l’opéron arabinose de E. coli ; ATG, codon d’initiation ; MCS, site de clonage multiple ; myc, gène codant l’épitope Myc (Glu-Gln-Lys-Leu-Ile-Ser-Glu-Glu-Asp-Leu) ; (His)₆, étiquette polyhistidine ; T, terminateur ; amp^R, gène de résistance à l’ampicilline.

FICHE DE DONNEES

Numéro attribué

573-01-ND230B

Masse pesée

10,8 mg

Opérateur Poste tél

Nicolas 76744

Structure de la molécule

Nom de la molécule (ou référence)	ND 230b
Formule brute	C21H32N2O4Si
Masse molaire	404,58
Famille	b-lactames
Libre ou Brevetée (L ou B ou ?)	Libre
Stock restant	OK
Solubilité DMSO	OK

Commentaires (stabilité, pureté, synthèse, autre solvant…)

Figure 43. Exemple d’une fiche de données d’une molécule entrant dans la Chimiothèque.

Figure 44. CMI de la molécule A en fonction de la concentration en antibiotique : isobologrammes de l’association molécule A/antibiotique.

En vert, cas d’une association synergique entre les molécules, en rose cas d’un effet additif et en bleu, cas d’un antagonisme.

Figure 45. Schéma du protocole suivi lors des expériences d’accumulation de la ciprofloxacine.

Tableau 17. Composition des tampons utilisés pour les techniques de biologie moléculaire.

Composants	Concentration
Tampon TAE
Tris	40 mM
Acide acétique	5 mM
EDTA	1 mM
pH 7,8
Tampon TBE
Tris	90 mM
Acide borique	90 mM
EDTA	2 mM
pH 8

Tableau 18. Composition des tampons utilisés pour l’extraction de l’ADN plasmidique.

Composants	Concentration
Tampon de lyse
Glucose	50 mM
Tris-HCl pH 8	25 mM
EDTA pH 8	10 mM
Solution de lyse
NaOH	0,2 N
SDS	1 %
Tampon de précipitation
Acétate de potassium	3 M
Acide acétique pH 4,8	5 M

Tableau 19. Séquence des amorces utilisées pour l’amplification du gène msr(A).

Nom	Séquence	Taille (nt)	Tm (°C)
msrABADA1	5’-GTG CTC GAG AAT GGA ACA ATA TAC AAT TAA-3’	30	48
msrABADA2	5’-GTT CTG CAG AGT TAT ATC ATG AAT AGA TTG-3’	30	52

Les séquences soulignées correspondent aux sites de restriction des enzymes XhoI ou PstI.

Tableau 20. Tampons utilisés pour la préparation de bactéries compétentes par choc thermique.

Composants	Concentration
Tampon TFB1
KCl	30 mM
CaCl2	10 mM
MnCl2	50 mM
RbCl	100 mM
Glycérol	15%
pH 5,8
Tampon TFB2
MOPS^1	10 mM
CaCl2	75 mM
RbCl	10 mM
Glycérol	15%
pH ajusté à 6,5 avec KOH 1M

Les tampons sont filtrés sur filtre Millipore 0,22 µM.

¹ MOPS : acide 3-(N-morpholino) propane sulfonique.

Tableau 21. Séquence des amorces utilisées pour le séquençage.

Nom	Séquence
msrABADA1	5’-GTG CTC GAG AAT GGA ACA ATA TAC AAT TAA-3’
msrABADA2	5’-GTT CTG CAG AGT TAT ATC ATG AAT AGA TTG-3’
msrA1	5’-ATG AAC CTA CAA ATC ACT TGG-3’
msrA2	5’-GAA TGG AAC ATT TGG AAG AAG-3’
msrA3	5’-TGA AGC ACT TGA GCG TTC TTG-3’

Tableau 22. Composition du gel de séquence.

Réactifs	Volumes
Solution concentrée d’acrylamide/bis-acrylamide + urée^a	50 ml
TEMED	35 µl
Persulfate d’ammonium 10%	250 µl
^a Concentrations finales : acrylamide 4,25 % et urée 6 M en tampon TBE

A

B

Traitement informatique de la séquence

Figure 46. Exemple d'un gel de séquençage et d'un électrophorégramme.

L’image de la migration électrophorétique des produits d’extension (A) est traitée à l’aide du logiciel « Sequencing Analysis 3.3 » afin de déterminer la séquence nucléotidique du produit de chaque piste (B).

Tableau 23. Composition du tampon échantillon.

Composants (pour 8 ml de tampon)	V (ml)
Eau distillée	4
Tris 0,5 M pH 6,8	1
Glycérol	0,8
SDS 10% (p/v)	1,6
2-b mercaptoéthanol	0,4
Bleu de bromophénol 0,05% (p/v)	0,2

Tableau 24. Composition des gels de séparation (12%) et de concentration (4%).

Composants (pour 10 ml de gel)	12%	4%
Eau distillée	3,35 ml	6,1 ml
Tris 1,5 M pH 8,8	2,5 ml	-
Tris 0,5 M pH 6,8	-	2,5 ml
SDS 10% (p/v)	100 µl	100 µl
Acrylamide/Bis-acrylamide (37,5/1)	4 ml	1,3 ml
Persulfate d’ammonium 10%	50 µl	50 µl
TEMED	5 µl	10 µl

Tableau 25. Composition du tampon de migration, pH 8,3.

Composants
Tris	25 mM
Glycine	0,2 M
SDS	0,1%

Tableau 26. Protéines utilisées pour la construction par homologie du modèle de la protéine Msr(A).

Protéines utilisées	Code PDB	Références
ArsA	1IHU	[456]
BtuCD	1L7V	[214]
CFTR	1R0X	[199]
GlcV	1OXX	[421]
HisP	1B0U	[145]
HlyB	1MTO	[377]
MalK	1Q12	[54]
MJ0796	1L2T	[389]
Rad50	1F2U	[137]
TAP1	1JJ7	[102]

MEQYTIKFNQINHKLTDLRSLNIDHLYAYQFEKIALIGGNGTGKTTLLNMIAQKTKPESG

TVETNGEIQYFEQLNMDVENDFNTLDGSLMSELHIPMHTTDSMSGGEKAKYKLANVISNY

SPILLLDEPTNHLDKIGKDYLNNILKYYYGTLIIVSHDRALIDQIADTIWDIQEDGTIRV

FKGNYTQYQNQYEQEQLEQQRKYEQYISEKQRLSQASKAKRNQAQQMAQASSKQKNKSIA

PDRLSASKEKGTVEKAAQKQAKHIEKRMEHLEEVEKPQSYHEFNFPQNKIYDIHNNYPII

AQNLTLVKGSQKLLTQVRFQIPYGKNIALVGANGVGKTTLLEAIYHQIEGIDCSPKVQMA

YYRQLAYEDMRDVSLLQYLMDETDSSESFSRAILNNLGLNEALERSCNVLSGGERTKLSL

AVLFSTKANMLILDEPTNFLDIKTLEALEMFMNKYPGIILFTSHDTRFVKHVSDKKWELT

GQSIHDIT

Figure 47. Séquence d’acides aminés de la protéine Msr(A) [357].

Les motifs Walker A et B du NBD N-terminal sont en caractères rouges gras, le motif Signature de ce domaine est souligné en rose ; les mêmes séquences dans le domaine C-terminal sont en bleu et turquoise. Les résidus glutamine du Q-linker sont en vert.

Figure 48. Exemple de code attribué aux molécules de la Chimiothèque.

Il s’agit de la molécule non brevetée de l’équipe 01 de l’UMR CNRS 7573, située dans la plaque n°12 et en position F09. Cette molécule se trouve dans la plaque n° 573-01-12.

Figure 49. Fiche d’enregistrement d’une molécule dans la base de données.

Les informations relatives à la molécule (structure, identificateurs…) sont entrées dans la base lors de la mise en plaque des produits ; les résultats de criblage (en bas) sont renseignés au fur et à mesure. Les résultats des tests sur les souches sensibles (souches ATCC de E. coli et S. aureus) figurent dans les cases rouges bilan ; dans le cas de molécules actives, les cases CMI sont également remplies. Les résultats des tests en présence d’antibiotique sur les deux souches résistantes de S. aureus étudiées sont également entrés dans la base (cases roses).

Tableau 27. CMI de différents antibiotiques vis-à-vis des souches sensibles de référence, déterminées avec le Biomek 2000.

	CMI (mg/ml)
Antibiotiques	E. coli ATCC 25922		P. aeruginosa ATCC 29653		S. aureus ATCC 25923			E. faecalis ATCC 29212
	réf^a	exp^b	réf	exp		réf	exp	réf	exp
Ampicilline	2 - 8	8	-	nd^c		0,25 - 1	0,5	0,5 - 2	4
CIP	0,004 - 0,015	0,003	0,25 - 1	0,5		0,12 - 0,5	0,25	0,25 - 2	2
ERY	-	nd	-	nd		0,12 - 0,5	0,25	1 - 4	1
Gentamicine	0,25 - 1	0,5	0,5 - 2	1		0,12 - 1	0,5	4 - 16	8
Tétracycline	1 - 4	2	8 - 32	32		0,12 - 1	0,5	8 - 32	16

^a CMI de référence (d’après [11]) ; ^b Moyenne des CMI déterminées par le Biomek 2000 et réalisées en triplicate ; ^c Non déterminé, résistance naturelle.

Figure 50. Courbes de croissance de E. coli ATCC 25922 (dilution initiale de l’inoculum au 1/100^ème), en fonction du temps en présence de différentes concentrations en DMSO, 0%, 1%, 5% et 10%.

Figure 51. Courbes de croissance de S. aureus ATCC 25923 en fonction du temps en présence de milieu MH seul, de MH + DMSO à 1% (témoin négatif), d’ampicilline à 16 µg/ml (témoin positif), et de quatre molécules testées à 100 µg/ml, appelées A, B, C et D. Ces quatre molécules représentent les exemples les plus typiques de courbes obtenues pour les molécules testées.

	01	02	03	04	05	06	07	08	09	10	11	12
A									+
B
C										++
D											++
E											+
F											+
G									++	++
H		++								++

Figure 52. Présentation des résultats d’une plaque de 80 molécules testées, obtenue après traitement par le programme informatique.

Les cases jaunes correspondent aux molécules inactives, les cases oranges aux molécules peu actives (+), et enfin les cases rouges aux molécules actives (++).

Figure 53. Répartition des molécules actives (155) vis-à-vis de S. aureus ATCC 25923 en fonction de leur CMI.

	R1	R2	R3	CMI (µg/ml)
Vibrindole	CH3	H	H	12,5
	CF3	H	H	6
	CF2Cl	H	H	6
	CH3	Br	Br	1,5
	CH2CH3	Br	Br	3
	CF3	Br	Br	1,5
	CF2Cl	Br	Br	1,5
	CF3	F	F	3
	CF3	NO2	NO2	1,5
	CF3	H	Br	1,5 ^*
	CF3	H	Me	5
	CF3	COOMe	COOMe	50
	CF3	H	COOMe	10

Figure 54. Comparaison de l’activité d’analogues du vibrindole : CMI vis-à-vis de la souche de S. aureus ATCC 25923 en fonction des substituants présents.

^* Dans le cas d’une seule substitution par Br en R₃, la CMI est de 1,5 µg/ml quelque soit la position du substituant sur le cycle.

Tableau 28. Résultats du criblage des extraits bruts du Brésil à 100 µg/ml : activité antibactérienne sur les souches sensibles E. coli et S. aureus ATCC, et une souche résistante, S. aureus NorA.

Famille	Genre et espèce	Tissu	E. coli ATCC 25922	S. aureus ATCC 25923	S. aureus NorA
Anacardiacea	Schinus terebinthifolius	Ecorce	-	+	+
		Feuille	-	+	-
Annonaceae	Annona crassifolia	Feuille	-	-	-
		Graine	-	+	-
		Ecorce	-	-	-
		Fruit	-	-	+
	Annona muricata	Feuille	-	+	-
	Annona salzmanii	Fruit	-	-	-
Apocynaceae	Aspidosperma cylindrocarpon	Feuille	-	-	-
	Condylocarpon isthmicum	Feuille	-	-	-
		Tige	-	-	-
	Himatanthus obovatus	Tige	-	-	-
Araliaceae	Didymopanax morototoni	Bois	-	-	-
Asclepiadaceae	Ditassa crassifolia	Feuille	-	-	-
		Tige	-	-	-
	Marsdenia altissima	Feuille	-	-	-
		Tige	-	-	-
Asteraceae	Senecio jurgensenii	Tige	-	-	-
Boraginaceae	Auxemma oncocalyx	Bois	-	-	-
Cecropiacea	Cecropia pachystachya	Racine	-	-	nd
		Ecorce	-	-	nd
		Tige	-	-	nd
		Feuille	-	-	nd
Celastraceae	Maytenus rigida	Ecorce	-	-	nd
		Feuille	-	-	nd
Euphorbiaceae	Jatropha elliptica	Feuille	-	-	-
		Rhizome	-	+	+
Fabaceae	Andira inermis	Feuille	-	-	-
	Caesalpinia pyramidalis	Feuille	-	-	-
		Tige	-	-	-
	Copaifera spp.	Huile	-	++^a	nd
	Dioclea virgata	Feuille	-	-	-
	Erythrina mulungu	Tige	-	-	-
		Ecorce	-	-	+
	Erythrina velutina	Feuille	-	-	-
	Pterodon polygalaeflorus	Tige	-	-	-
		Ecorce	-	-	-
		Racine	-	-	-
		Feuille	-	-	-
Lauraceae	Ocotea glomerata	Feuille	-	-	-
		Tige	-	-	-
Lythraceae	Lafoensia pacari	Feuille	-	-	-
		Ecorce	-	+	++
		Tige	-	-	+
Myrtaceae	Syzygium jambolanum	Racine	-	-	-
Olacaceae	Ximenia americana	Feuille	-	-	-
		Ecorce	-	-	-
Piperaceae	Piper arboreum	Feuille	-	-	-
Rhamnaceae	Ziziphus joazeiro	Feuille	-	-	-
		Ecorce	-	-	-
Sapindaceae	Cupania oblongifolia	Bois	-	-	-
		Feuille	-	-	-
	Cupania platycarpa	Bois	-	-	-
		Ecorce	-	-	-
	Magonia pubescens	Graine	-	-	-
					(à suivre)
Tableau 28. Résultats du criblage des extraits bruts du Brésil à 100 µg/ml. (suite)
Famille	Genre et espèce	Tissu	E. coli ATCC 25922	S. aureus ATCC 25923	S. aureus NorA
Sapindaceae	Serjania lethalis	Tige	-	+	+
		Feuille	-	++^b	++
	Talisia esculenta	Bois	-	-	+
Simaroubacea	Quassia amara	Feuille	-	-	-
	Simarouba amara	Tige	-	-	-
		Racine	-	-	-
		Feuille	-	-	-
Sterculiaceae	Guazuma ulmifolia	Ecorce	-	-	-
Verbenaceae	Aegiphila lhotskiana	Tige	-	-	-
		Feuille	-	-	-
Zingiberaceae	Hedychium coronarium	Feuille	-	-	-
^aCMI = 100 µg/ml ; ^b CMI = 64 µg/ml ; -, extrait inactif ; +, extrait peu actif ; ++, extrait actif ; nd, non déterminé.  Les extraits bruts qui ont été purifiés par la suite sont en caractères gras.

Figure 55. Schéma général du procédé d’extraction et de purification des extraits naturels du Brésil.

A partir de la matière sèche d’une partie de la plante, une percolation à l’éthanol permet d’obtenir l’extrait brut. Lorsqu’une activité biologique de l’extrait brut est détectée, une extraction à l’hexane, puis au méthanol et enfin à l’acétate d’éthyle est menée, conduisant respectivement aux fractions E-Hex, E-CHCl₃, E-AcOEt et E-H₂O. Si l’une de ces fractions se révèle active, elle est purifiée sur colonne, éventuellement en plusieurs étapes : à l’issue de la première colonne, les fractions C-solvant_i sont obtenues ; si l’une de ces fractions est active, une seconde purification sur colonne, avec des conditions expérimentales éventuellement différentes, est réalisée, conduisant aux fractions CC-solvant_i.

Tableau 29. Résultats du criblage (à 100 µg/ml) des fractions obtenues après purification d’extraits bruts de six plantes du Brésil.

Espèce et extraits				S. aureus ATCC	S. aureus NorA	S. aureus NorA + CIP
Serjania lethalis
Tige	Brut			+	+	++
	E-Hex			-	-	-
	E-CHCl3			-	-	++
	E-AcOEt			++	++	++
	E-H20			++	++	++
Feuilles	Brut			++^b	++	++
	E-Hex			-	-	-
	E-CHCl3			-	-	-
	E-AcOEt			++	+	++
Schinus terebenthifolius
Ecorce	Brut			+	+	+
	E-Hex			+	+	-
	E-CHCl3			-	-	++
	E-AcOEt			-	-	-
	E-H2O			-	-	-
	E-Hex /	C-Hex/AcOEt 2,5%		-	nd	-
		C-Hex/AcOEt 5%		-	nd	-
		C-Hex/AcOEt 10%		-	nd	+
		C-Hex/AcOEt 25%		+	nd	+
		C-Hex/AcOEt 50%		++	nd	++
		C-AcOEt		-	nd	-
		C-MeOH		-	nd	-
Jatropha elliptica
Rhizome	Brut			+	+	++
	Jatropholone			-	-	-
	Acide 3-O-acétyl aleuritolique			-	-	-
	Propacine			-	-	+
	F-(1-7)			++^a	++	++
	F-(8-15)			-	-	-
	F-(16-21)			-	-	++
	F-(22-27)			-	-	-
Annona crassifolia
Graine	Brut			+	-	++
	E-CHCl3			-	-	++
	E-AcOEt			-	-	+
	E-H2O			-	-	-
	E-AcOEt /	C-Hex/AcOEt 25%		-	nd	++
		C-Hex/AcOEt 50%		-	nd	-
		C-Hex/AcOEt 70%		-	nd	+
		C-MeOH		-	nd	++
		C-AcOEt		++	nd	++
Annona muricata
Feuille	Brut			+	-	+
	E-CHCl3			-	-	+
	E-AcOEt+EtOH			-	-	-
	E-H2O/EtOH (7/3)			-	-	-
	E-H2O/EtOH (1/1)			-	-	++
						(à suivre)
Tableau 29. Résultats du criblage (à 100 µg/ml) des fractions obtenues après purification d’extraits bruts de six plantes du Brésil. (suite)
Espèce et extraits				S. aureus ATCC	S. aureus NorA	S. aureus NorA + CIP
Lafoensia pacari
Ecorce	Brut			+	++	++
	E-Hex			-	-	-
	E-CHCl3			-	-	-
	E-AcOEt			+	++	++
	E-H2O			+	++	++
	E-AcOEt /	C-CHCl3		-	-	-
		C-AcOEt		-	-	-
		C-AcOEt/MeOH 10 %		+	+	++
		C-MeOH		-	-	-
		C-MeOH/H2O 10 %		-	-	-
C-AcOEt/MeOH 10 % /			CC-H2O	-	-	-
			CC-EtOH/H2O	-	-	-
			CC-EtOH	-	-	-
			CC-AcOEt	-	-	-
			CC-MeOH	-	-	-
^aCMI = 100 µg/ml ; ^b CMI = 64 µg/ml ; -, extrait inactif ; +, extrait peu actif ; ++, extrait actif ; nd, non déterminé. Les fractions qui ont été purifiées par la suite sont en caractères gras.

Tableau 30. CMI des extraits bruts et des fractions purifiées, vis-à-vis de la souche de S. aureus ATCC 25923.

Espèce et extraits		CMI (µg/ml)
Copaifera spp.
Huile	Brut	100
Schinus terebenthifolius
Ecorce	Brut	> 100
	E-Hex/ C-Hex/AcOEt 50%	64
	E-Hex/ C-Hex/AcOEt 25%	125
Annona crassifolia
Graine	Brut	> 100
	E-AcOEt / C-Ac0Et	100
Jatropha elliptica
Rhizome	Brut	> 100
	F-(1-7)	100
Serjania lethalis
Tige	Brut	> 100
	E-AcOEt	100
	E-H20	100
Feuilles	Brut	64
	E-AcOEt	100

Tableau 31. CMI de D06 et des analogues les plus actifs vis-à-vis des souches sensibles de E. coli et S. aureus, et de l’antibiotique témoin, l’ampicilline.

	CMI (µg/ml)
Molécules	E. coli ATCC 25922	S. aureus ATCC 25923
Ampicilline	8	0,5
126-01-02-L-D06	< 1,5	< 0,37
126-01-03-L-H02	6	0,75
126-01-03-L-G03	3	1,5
126-01-03-L-A06	6	1,5
126-01-03-L-E07	6	3
126-01-03-L-E06	12,5	3
126-01-05-L-E04	12,5	3
126-01-06-L-H07	12,5	3
126-01-05-L-G11	25	3
126-01-03-L-F02	25	3
126-01-05-L-D11	50	3
126-01-06-L-G08	50	3
126-01-06-L-D08	> 100	3

Figure 56. Répartition de D06 et de ses analogues actifs (38 molécules), en fonction de leur CMI vis-à-vis des souches sensibles de E. coli et S. aureus.

Tableau 32. Détermination de CMI d’antibiotiques vis-à-vis des souches SA-1199, sensible, et SA-1199B, résistante.

	CMI (µg/ml)
Composé	SA-1199		SA-1199B
	réf	exp	réf	exp
CIP	0,3	0,37	6	16
CIP + RES^1	-	0,37	-	4
NOR	1	1	64	64
NOR + RES	0,5	0,75	8	24
PEF	0,65	1	12,5	8
PEF + RES	-	nd	-	8
EtBr	8	8	64	48
EtBr + RES	2	nd	8	12
ACR	6,3	4	25	48
Cétrimide	0,4	0,5	6,3	4
Chlorure de benzalkonium	0,8	1	3,1	4

¹ Réserpine à 20 µg/ml.

réf, CMI issues des références [161, 162, 165] ; exp, CMI expérimentale (moyenne de 3 CMI déterminées par le Biomek 2000) ; nd, non déterminé ; -, données non référencées.

Figure 57. Courbes de croissance sur 24h de la souche résistante SA-1199B (A) et de la souche sensible SA-1199 (B) : différents témoins sont réalisés.

Figure 58. Répartition des inhibiteurs potentiels (126) de la pompe d’efflux NorA en fonction de leur concentration qui permet de restaurer la CMI de CIP à 4 µg/ml vis-à-vis de la souche de S. aureus NorA.

Le rouge représente les benzothiophènes, tels que G03, et les benzofuranes.

Figure 59. Isobologramme obtenu pour l’association G03 - CIP vis-à-vis de la souche de S. aureus NorA.

Tableau 33. Résultats du criblage des extraits bruts du Brésil à 100 µg/ml sur la souche résistante de S. aureus NorA en association avec CIP, activité antibactérienne sur la souche de S. aureus NorA, et rappel de l’activité sur la souche sensible de S  aureus ATCC 25923.

		A	B	C
Genre et espèce	Tissu	S. aureus NorA + CIP	S. aureus NorA	S. aureus ATCC 25923
Schinus terebinthifolius	Ecorce	+	-	+
	Feuille	++	-	+
Annona crassifolia	Graine	++	-	+
	Ecorce	++	-	-
	Fruit	++	+	-
Annona muricata	Feuille	+	-	+
Aspidosperma cylindrocarpon	Feuille	++	-	-
Didymopanax morototoni	Bois	++	-	-
Auxemma oncocalyx	Bois	++	-	-
Cecropia pachystachya	Racine	++	-	-
	Ecorce	++	-	-
	Tige	++	-	-
Jatropha elliptica	Rhizome	++	+	+
Andira inermis	Feuille	++	-	-
Caesalpinia pyramidalis	Feuille	++	-	-
	Tige	++	-	-
Erythrina mulungu	Tige	++	-	-
	Ecorce	++	+	-
Pterodon polygalaeflorus	Tige	++	-	-
	Racine	++	-	-
Ocotea glomerata	Feuille	++	-	-
Lafoensia pacari	Ecorce	++	++	+
	Tige	++	+	-
Ximenia americana	Ecorce	++	-	-
Cupania oblongifolia	Feuille	++	-	-
Serjania lethalis	Tige	++	+	+
	Feuille	++	++	++
Simarouba amara	Tige	++	-	-
Aegiphila lhotskiana	Tige	++	-	-
	Feuille	++	-	-

Les extraits bruts marqués en rouge sont des inhibiteurs potentiels de la pompe d’efflux NorA ; les extraits qui ont été purifiés par la suite sont en caractères gras.

Tableau 34. Résultats du criblage des fractions obtenues après purification d’extraits bruts de neuf plantes du Brésil en vue de la recherche d’inhibiteurs de la pompe NorA.

Espèce et extraits				S. aureus ATCC	S. aureus NorA	S. aureus NorA + CIP
Simarouba amara
Tige		Brut		-	-	++
		E-Hex		-	nd	+
		E-CHCl3		-	nd	+
		E-AcOEt		-	nd	+
		E-H2O		-	nd	-
Erythrina mulungu
Tige		Brut		-	-	++
		E-Hex		-	nd	+
		E-CHCl3		-	nd	-
Didymopanax morototoni
Bois		Brut		-	-	++
		E-Hex		-	-	-
		E-CHCl3		-	-	-
		E-AcOEt		-	-	-
		E-H2O		-	-	-
		E- CHCl3/	C-Hex/ CHCl3 (1/1)	-	-	-
			C-Hex/ CHCl3 (1/2)	-	-	-
			C- CHCl3	-	-	-
			C-CHCl3/MeOH	-	-	-
			C-CHCl3/MeOH 5%	-	-	-
			C-CHCl3/MeOH 10%	-	-	-
			C-MeOH	-	-	-
Schinus terebenthifolius
Ecorce		Brut		+	+	+
		E-Hex		+	+	-
		E-CHCl3		-	-	++
		E-AcOEt		-	-	-
		E-H2O		-	-	-
Jatropha elliptica
Rhizome		Brut		+	+	++
		Jatropholone		-	-	-
		Acide 3-O-acétyl aleuritolique		-	-	-
		Propacine		-	-	+
		F-(1-7)		++^a	++	++
		F-(8-15)		-	-	-
		F-(16-21) = composé B		-	-	++
		F-(22-27)		-	-	-
Annona crassifolia
Ecorce		Brut		-	-	++
		E-Hex		-	-	-
		E-Hex/CHCl3		-	-	-
		E-CHCl3		-	-	-
		E-MeOH		-	-	-
		E-AcOEt		-	-	-
		E-H2O		-	-	-
						(à suivre)
Tableau 34. Résultats du criblage des fractions obtenues après purification d’extraits bruts de neuf plantes du Brésil en vue de la recherche d’inhibiteurs de la pompe NorA. (suite)
Espèce et extraits				S. aureus ATCC	S. aureus NorA	S. aureus NorA + CIP
Annona crassifolia
Ecorce		E-CHCl3/	C-Hex/CHCl3 (1/1)	-	-	+
			C-CHCl3	-	-	++
			C-AcOEt	-	-	++
Graine		Brut		+	-	++
		E-CHCl3		-	-	++
		E-AcOEt		-	-	+
		E-H2O		-	-	-
		E-AcOEt /	C-Hex/AcOEt 70%	-	nd	+
			C-Hex/AcOEt 50%	-	nd	-
			C-Hex/AcOEt 25%	-	nd	++
			C-MeOH	-	nd	++
			C-AcOEt	++	nd	++
Annona muricata
Feuille		Brut		+	-	+
		E-CHCl3		-	-	+
		E-AcOEt+EtOH		-	-	-
		E-H2O/EtOH (7/3)		-	-	-
		E-H2O/EtOH (1/1)		-	-	++
E-H2O/EtOH (1/1)			C-EtOH	-	-	+
			C-AcOEt/EtOH (1/1)	-	-	+
			C-MeOH	-	-	+
E-H2O/EtOH (1/1)			F3 F(16)	-	nd	-
			F4 F(16)	-	nd	-
			F5 F(16)	-	nd	-
			F1 F(17)	-	nd	-
			F2 F(17)	-	nd	-
			F(3-5) F(17)	-	nd	++
			F6 F(17)	-	nd	-
Lafoensia pacari
Ecorce	Brut			+	++	++
	E-Hex			-	-	-
	E-CHCl3			-	-	-
	E-AcOEt			+	++	++
		E-H2O		+	++	++
		E-AcOEt /	C-CHCl3	-	-	-
			C-AcOEt	-	-	-
			C-AcOEt/MeOH 10 %^*	+	++	++
Serjania lethalis
Tige		Brut		+	+	++
		E-Hex		-	-	-
		E-CHCl3		-	-	++
		E-AcOEt		++	++	++
		E-H2O		++	++	++
Feuilles		Brut		++^b	++	++
		E-Hex		-	-	-
		E-CHCl3		-	-	-
		E-AcOEt		++	+	++
^aCMI = 100 µg/ml ; ^b CMI = 64 µg/ml ; ^*fraction purifiée mais toutes les fractions résultantes sont dépourvues d’activité (cf. Tableau 29) ; -, extrait inactif ; +, extrait peu actif ; ++, extrait actif ; nd, non déterminé.

Figure 60. Structure du 4-phényl-2,6-diméthyle-3,5-pyridinedicarboxylate de diéthyle (composé B), isolé du rhizome de J. elliptica, qui présente une bonne activité d’inhibiteur de la pompe d’efflux NorA.

Tableau 35. Effet de l’association de G03 avec différentes molécules sur leurs CMI vis-à-vis de la souche résistante SA-1199B et sur la souche parentale sensible SA-1199.

		CMI (µg/ml)
		G03	CIP	EtBr
SA-1199B	Pas d’association	> 200	16	48
	+ RES 20 µg/ml		4 (4)^*	12 (4)
	+ G03 20 µg/ml		4 (4)	8 (6)
SA-1199	Pas d’association		0,37	8
	+ RES 20 µg/ml		0,37	nd
	+ G03 20 µg/ml		0,25	4 (2)

^* Les valeurs indiquées entre parenthèses correspondent au facteur de diminution de la CMI ; nd, non déterminé.

Tableau 36. Effet de l’association du composé B avec différentes molécules sur leurs CMI vis-à-vis de la souche résistante SA-1199B et sur la souche parentale sensible SA-1199.

		CMI (µg/ml)
		B	CIP	NOR	PEF	ACR	EtBr
SA-1199B	Pas d’association	> 500	16	64	8	48	48
	+ RES 20 µg/ml		4 (4)^*	24 (3)	8 (1)	24 (2)	12 (4)
	+ B 100 µg/ml		3 (5,5)	12 (5,5)	6 (1,5)	4 (8,5)	3 (17)
	+ B 75 µg/ml		4 (4)	16 (4)	6 (1,5)	6 (4)	6 (8,5)
	+ B 50 µg/ml		6 (3)	32 (2)	8 (1)	12 (4)	12 (4)
	+ B 25 µg/ml		8 (2)	48 (1,5)	8 (1)	48 (1)	24 (2)
SA-1199	Pas d’association		0,37	1
	+ RES 20 µg/ml		0,37	0,75
	+ B 100 µg/ml		0,25	0,5

^* Les valeurs indiquées entre parenthèses correspondent au facteur de diminution de la CMI.

Figure 61. Isobologrammes obtenus pour l’association composé B - CIP (A) et composé B- EtBr (B) vis-à-vis de la souche de S. aureus NorA.

Figure 62. Efflux de EtBr (10 µg/ml) par la souche résistante SA-1199B et par la souche sensible SA-1199, exprimé en unités arbitraires de fluorescence en fonction du temps, sans inhibiteur, et en présence des inhibiteurs de référence RES et CCCP à 20 µg/ml.

Figure 63. Accumulation de EtBr (10 µg/ml) par la souche résistante SA-1199B et par la souche sensible SA-1199, exprimé en unités arbitraires de fluorescence en fonction du temps, sans inhibiteur, et en présence des inhibiteurs de référence RES et CCCP à 20 µg/ml. Les inhibiteurs sont ajoutés après 10 min, comme indiqué par la flèche.

Figure 64. Accumulation de la ciprofloxacine (10 µg/ml) par la souche résistante SA 1199B et par la souche sensible SA 1199. Les résultats sont exprimés en concentration intracellulaire de CIP (µg/ml) en fonction du temps. La RES est ajoutée (20 µg/ml) après 10 minutes, comme indiqué par la flèche.

Figure 65. Accumulation de EtBr (10 µg/ml) par la souche résistante de S. aureus NorA (A), exprimé en unités arbitraires de fluorescence en fonction du temps, et efflux de EtBr (10 µg/ml) par cette même souche (B).

Expériences sans inhibiteur, en présence des inhibiteurs de référence RES et CCCP à 20 µg/ml, et en présence de différentes concentrations de la molécule G03. La même légende est employée pour les deux graphiques. Pour l’expérience d’accumulation de EtBr (A), les inhibiteurs sont ajoutés après 10 min, comme indiqué par la flèche.

Figure 66. Efflux de EtBr (10µg/ml) par la souche résistante de S. aureus NorA en présence de deux analogues de G03, le benzothiophène F10 et le benzofurane E04. Les résultats sont exprimés en unités arbitraires de fluorescence en fonction du temps ; les deux molécules ainsi que la RES sont employées à la concentration de 20 µg/ml.

Figure 67. Efflux de EtBr (10µg/ml) par la souche résistante de S. aureus NorA en présence de deux indoles, les molécules LEDSS 01-05-L-A02 et 01-05-L-E11. Les résultats sont exprimés en unités arbitraires de fluorescence en fonction du temps ; les molécules ainsi que la RES sont employées à la concentration de 20 µg/ml, sauf * à 10 µg/ml.

Figure 68. Structures des indoles utilisés pour l’expérience d’efflux de EtBr par S. aureus NorA.

Figure 69. Efflux de EtBr (10 µg/ml) par la souche résistante de S. aureus NorA (A), exprimé en unités arbitraires de fluorescence en fonction du temps, et accumulation de EtBr (10 µg/ml) par cette même souche (B), sans inhibiteur, en présence des inhibiteurs de référence RES et CCCP à 20 µg/ml, et en présence de différentes concentrations du composé B. La même légende est employée pour les deux graphiques ; pour l’expérience d’accumulation de EtBr (B), les inhibiteurs sont ajoutés après 10 min, comme indiqué par la flèche.

Figure 70. Accumulation de CIP par la souche de S. aureus NorA, sans inhibiteur, en présence des inhibiteurs de référence RES et CCCP à 20 µg/ml, et en présence de différentes concentrations du composé B. Les inhibiteurs sont ajoutés après 6 min, comme indiqué par la flèche.

Tableau 37. Effet de l’association de G03 avec CIP et EtBr sur leurs CMI vis-à-vis de la souche résistante de B. subtilis ΔΔNA.

	CMI (µg/ml)
	G03	CIP	EtBr
Pas d’association	> 200	1	32
+ RES 20 µg/ml		0,5 (2)^*	8 (4)
+ G03 20 µg/ml		0,25 (4)	4 (6)

^* Les valeurs indiquées entre parenthèses correspondent au facteur de diminution de la CMI.

Figure 71. Isobologramme obtenu pour l’association G03-CIP vis-à-vis de la souche de B.  subtilis DDNA.

Figure 72. Efflux de EtBr (5 µg/ml) par la souche résistante de B. subtilis DDNA, exprimé en unités arbitraires de fluorescence en fonction du temps, sans inhibiteur, en présence des inhibiteurs de référence RES et CCCP à 20 µg/ml, et en présence de la molécule G03 à 20 µg/ml.

Figure 73. CMI de quatre associations molécule – érythromycine vis-à-vis de la souche de S. aureus Msr(A).

Les molécules F08, D04 et F02 montrent une synergie avec ERY alors que la molécule E08 présente un simple effet additif. Les molécules F02 et E08 sont sans effet sur la CMI de ERY lorsqu’elles sont employées à 25 µg/ml, les points correspondants ne sont pas indiqués pour plus de clarté sur le graphique.

Figure 74. Structures de deux touches issues du criblage vis-à-vis de S. aureus Msr(A).

Figure 75. Accumulation de [¹⁴C]-érythromycine (0,75 µg/ml) par la souche résistante de S. aureus Msr(A) et la souche sensible de S. aureus ATCC 25923, sans inhibiteur, et en présence de CCCP (100 µM) ou d’arsenate de sodium (10 mM).

Tableau 38. Détermination de CMI de streptogramines vis-à-vis de souches de S. epidermidis.

	CMI (µg/ml)
	Pristinamycine	Pristinamycine II A (facteur A)	Pristinamycine I A (facteur B)
S. epidermidis BM 3302	0,12	2	16
S. epidermidis VgaA IPF263	0,5	64	16
S. epidermidis VgaB IPF761	4	8	16

MEQYTIKFNQINHKLTDLRSLNIDHLYAYQFEKIALIGGNGTGKTTLLNMIAQKTKPESG

TVETNGEIQYFEQLNMDVENDFNTLDGSLMSELHIPMHTTDSMSGGEKAKYKLANVISNY

SPILLLDEPTNHLDKIGKDYLNNILKYYYGTLIIVSHDRALIDQIADTIWDIQEDGTIRV

FKGNYTQYQNQYEQEQLEQQRKYEQYISEKQRLSQASKAKRNQAQQMAQASSKQKNKSIA

PDRLSASKEKGTVEKAAQKQAKHIEKRMEHLEEVEKPQSYHEFNFPQNKIYDIHNNYPII

AQNLTLVKGSQKLLTQVRFQIPYGKNIALVGANGVGKTTLLEAIYHQIEGIDCSPKVQMA

YYRQLAYEDMRDVSLLQYLMDETDSSESFSRAILNNLGLNEALERSCNVLSGGERTKLSL

AVLFSTKANMLILDEPTNFLDIKTLEALEMFMNKYPGIILFTSHDTRFVKHVSDKKWELT

GQSIHDIT

Figure 76. Séquence d’acides aminés de la protéine Msr(A) [357].

Les motifs Walker A et B du NBD N-terminal sont en caractères rouges gras, le motif Signature en rose ; les mêmes séquences dans le domaine C-terminal sont en bleu et turquoise. En orange est représentée la partie centrale construite, les résidus soulignés sont ceux pour lesquels il existe un chevauchement (jonction N-terminale) ou un décalage (jonction C-terminale) entre les NBD et la partie centrale modélisée. Les résidus aromatiques en vert sont ceux utilisés dans l’alignement avec le résidu aromatique situé avant le motif Walker A.

Tableau 39. Récapitulatif des modèles construits pour la protéine Msr(A).

Orientation des NBD	selon le mutant MJ0796	selon la protéine ArsA	selon GRAMM
Liens
Modèle A	modèle 7	modèle 1	modèle 4
Modèle B	à faire	modèle 2	modèle 5
Modèle C	modèle 8	modèle 3	modèle 6

Figure 77. alignements réalisés pour la modélisation du domaine NBD C-terminal de la protéine Msr(A).

Séquence DIQEDGTIRVFKGNYTQYQNQYEQEQLEQQRKYEQYISEKQRLSQASKAKRNQAQQMAQASSKQKNKSIA

SSPro EEECCCEEEEECCCHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHCCCCCCCCCCCC

3D-PSSM CCCCCCEEEEEEEEEEECCCCCCHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHCCCCCCCH

NNPredict -------EEEE-------------HHHHHH--H-EHHHHHHHHHHH-HH-HHHHHHHHHH----------

PHD HH-----EEEE----HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH------------

APSSP EECCCCEEEEEECCCHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHCCCCCCC

PSA HHHLLLLSSSSLLLLLLHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHLLLLLL

Séquence PDRLSASKEKGTVEKAAQKQAKHIEKRMEHLEEVEKPQSYHEFNFPQNKIYDIHNNYP

SSPro CCCCCHCHHCCCHHHHHHHHHHHHHHHHHHHCCCCCCCCCCCCCCCHHHHHHHHCCCE

3D-PSSM HHHHHCCCCCCHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHCCCCCCCCCCCEECCCCCHHHHHCCCC

NNPredict -----------HHHHHHHHHHHHHHHHHHHH--H----------------E-------

PHD --------------HHHHHHHHHHHHHHHHHHH-------------------------

APSSP CCHHCHHCCCCHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHCCCCCCCCCCCCCCCCEEECCCCCC

PSA LLLHHHHLLLLLHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLL

Figure 78. Comparaison des résultats de prédiction de la structure secondaire pour la partie centrale de Msr(A) (résidus D171 à P298).

La séquence d’aa de la protéine Msr(A) est en haut (code à une lettre), les résultats de prédiction de structure secondaire obtenus avec 6 programmes en dessous, H, hélice ; E, feuillet ; C, « coil » ; -, pas de prédiction.

Figure 79. Modèles établis pour la partie centrale de la protéine Msr(A).

Figure 80. Modèles 7, à gauche, et 8, à droite, établis pour la protéine Msr(A).

Les molécules d’ATP ne sont pas représentées, les hélices a sont en rose et les feuillets b en orange.

Figure 81. Inhibiteurs de la pompe NorA contenant un motif indole.

L’inhibiteur de référence, la réserpine, un nitroindole identifié par Markham et al. [240] et quatre molécules identifiées lors de notre criblage dont la concentration efficace indique la concentration de molécule qui permet de restaurer la CMI de CIP à 4 µg/ml vis-à-vis de S. aureus NorA.

Tableau 40. CMI de différents antibiotiques sur la souche résistante de L. lactis MG1363 LmrP et sur la souche sensible de L. lactis MG1363.

	CMI (µg/ml)
	ERY	Lincomycine	Pristinamycine	Tétracycline
L. lactis LmrP	> 512	64-128	1	1
L. lactis	< 1	2-4	1-0,5	1

Figure 82. Efflux de EtBr par la souche résistante de L. lactis LmrP, exprimé en unités arbitraires de fluorescence en fonction du temps, sans inhibiteur et en présence de CCCP (20 µg/ml).

Figure 83. Fenêtre de travail du menu Edit du robot Biomek 2000.

Figure 84. Représentation de la surface de travail du robot Biomek 2000.

Figure 85. Représentation de la palette de fonction du Biomek 2000 et illustration des principales fonctions utilisées.

Figure 86. Fenêtre de transfert permettant de définir les paramètres des opérations de pipetage.