b c d
Figure 1.
Structures des quinolones.
(a) Structure de base des quinolones et rôle des substituants ; A
et B indiquent les cycles, les numéros indiquent la position des substituants (d’après
[41]). (b) Structure de l’acide nalidixique, quinolone de première génération.
(c) Structures de fluoroquinolones de deuxième génération utilisées dans cette
étude. (d) Structure d’une fluoroquinolone de troisième génération.
Mycinose
Figure 2.
Structure de deux macrolides naturels, l’érythromycine A, macrolide à 14
chaînons, et la tylosine, macrolide à 16 chaînons.
Tableau 1. Origine des macrolides naturels.
Macrolide |
Nombre de chaînons |
Organisme producteur |
Erythromycine |
14 |
Saccharopolyspora erythraea |
Oléandomycine |
14 |
Streptomyces antibioticus |
Carbomycine |
16 |
Streptomyces thermotolerans |
Josamycine |
16 |
Streptomyces
narbonensis var.
josamycetius nova sp |
Midécamycine |
16 |
Streptomyces mycarofaciens |
Spiramycine |
16 |
Streptomyces ambofaciens |
Tylosine |
16 |
Streptomyces fradiae |
Figure 3.
Structure d’un kétolide, la télithromycine.
Figure 4. Structure de la lincomycine
et de son dérivé chloré, la clindamycine.
Figure
5.
Structure des streptogramines B, pristinamycine IA et quinupristine, et des
streptogramines A, pristinamycine IIA et dalfopristine.
Figure 6.
Schéma du mode d’action des quinolones sur l’ADN gyrase, d’après [83].
(a) L’ADN gyrase et l’ADN interagissent et forment un complexe de clivage. (b) Effet bactériostatique des quinolones qui piègent le complexe de clivage de manière réversible, sauf lorsque l’ADN gyrase présente des mutations. (c) Libération irréversible de fragments d’ADN coupés à partir des complexes de clivage, faisant intervenir un facteur protéique non déterminé (voie sensible au chloramphénicol), entraînant la mort cellulaire. (d) Dissociation irréversible des sous-unités de l’ADN gyrase sous l’action des quinolones et libération de fragments d’ADN coupés (voie non sensible au chloramphénicol).
Figure 7.
Structure secondaire de
l’ARNr 23S (d’après [18]).
Les hélices sont numérotées selon Leffers et al. [198]. La boucle centrale du domaine V et l’épingle 35 du domaine II, impliquées dans la liaison des macrolides, sont désignées par des flèches.
Figure 8.
Structure de la sous-unité
50S du ribosome de Deinococcus radiodurans complexée à l’érythromycine
[375].
L’antibiotique, en rouge, est fixé dans le tunnel de sortie des
polypeptides. Les protéines ribosomiques sont en jaune, l’ARNr 23S est en bleu
foncé et l’ARNr 5S est en bleu clair.
Figure 9.
Le tunnel de sortie des
polypeptides (d’après [290]).
(A) La sous-unité 50S a été coupée en deux dans la longueur du tunnel et ouverte comme un livre. L’ARNr est en bleu clair; les protéines sont en vert. PT, centre peptidyltransférase. (B) Localisation des domaines de l’ARNr 23S et des protéines ribosomiques (L) autour du tunnel.
Figure 10. Représentation schématique de la paroi des bactéries à Gram positif, des
bactéries à Gram négatif et des mycobactéries
[151].
Figure 11. Représentation schématique de la membrane externe de la paroi des bactéries à Gram négatif [151].
Figure 12.
Représentation schématique des
différents systèmes d’efflux actif, d’après [319].
ATB, antibiotique substrat.
Figure 13. Organisation modulaire des protéines ABC.
Distinction entre les protéines ABC bactériennes, formées de plusieurs protéines (une couleur par protéine) et leurs homologues eucaryotes où généralement une protéine constitue le transporteur complet. Les flèches rouges indiquent la direction du transport ; dans le cas des systèmes d’import bactériens, la protéine extracellulaire liant le substrat est figurée en gris.
Figure 14. Organisation structurale des transporteurs
ABC.
Les deux domaines transmembranaires (TMD) sont chacun constitué de 6 hélices a membranaires. Les domaines de fixation des nucléotides (NDB) sont situés du côté cytoplasmique de la membrane et contiennent les motifs conservés impliqués dans l’hydrolyse de l’ATP (motifs Walker A et Walker B, motif Signature). Les résidus les plus conservés de ces motifs sont indiqués.
Figure 15.
Représentation
schématique des motifs conservés d’un domaine liant les nucléotides.
Tableau 2. Protéines de la famille ABC cristallisées.
Nom |
Organisme |
Fonction |
Résolution (Å) |
Références |
Cristaux obtenus |
|
Domaines liant les nucléotides isolés |
|
|
|
|||
CFTR |
Souris |
Canal Cl- |
2,2 à 2,55 |
[199] |
Sans nucléotide, avec ADP, avec ATP |
|
CysA |
A. acidocaldarius |
Import des sulfates (supposé) |
2,0 |
[374] |
Sans nucléotide |
|
GlcV |
S. solfataricus |
Import du glucose |
1,65 à 2,1 |
[421] |
Sans nucléotide, avec ADP-Mg2+, avec AMP-PNP- Mg2+ |
|
HisP |
S. typhimurium |
Import de l’histidine |
1,5 |
[145] |
Avec ATP |
|
HlyB |
E. coli |
Export de l’hémolysine |
2,6 |
[377] |
Sans nucléotide |
|
MalK |
T. litoralis |
Import du maltose |
1,9 |
[78] |
Avec pyrophosphate |
|
MalK |
E. coli |
Import du maltose |
2,6 à 2,9 |
[54] |
Sans nucléotide et avec ATP |
|
MJ0796 |
M. jannaschii |
? |
2,7 |
[450] |
Avec ADP-Mg2+ |
|
mutant E171Q |
|
1,9 |
[389] |
Avec ATP-Na+ |
||
MJ1267 |
M. jannaschii |
Transport des acides aminés Leu, Ile, Val (supposé) |
1,6 |
[170] |
Sans nucléotide et avec ADP-Mg2+ |
|
RbsA |
E. coli |
Import du ribose |
2,5 |
[14] |
|
|
TAP1 |
H. sapiens |
Présentation de l’antigène |
2,4 |
[102] |
Avec ADP-Mg2+ |
|
|
|
|
|
|
|
|
Transporteurs ABC complets |
|
|
|
|
||
BtuCD |
E. coli |
Import de la vitamine B12 |
3,2 |
[214] |
|
|
MsbA |
E. coli |
Export du lipide A et du LPS |
4,5 |
[51] |
|
|
|
V. cholera |
3,8 |
[50] |
|
||
|
S. typhimurium |
4,2 |
[345] |
Avec Mg-ADP-Vi et LPS |
||
|
|
|
|
|
|
|
Autres protéines ABC |
|
|
|
|
||
MutS |
E. coli |
Réparation de l’ADN |
2,2 |
[192, 301] |
|
|
SMC |
T. maritima |
Maintenance
structurale des chromosomes |
3,1 |
[222] |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
(à
suivre) |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Tableau 2. Protéines de la famille ABC cristallisées. (suite) |
||||||
|
|
|
|
|
||
Nom |
Organisme |
Fonction |
Résolution (Å) |
Références |
Cristaux obtenus |
|
Rad50 |
P. furiosus |
Réparation de l’ADN double brin |
1,6 à 2,6 |
[137] |
Sans nucléotide, avec ATP, avec AMP-PNP- Mg2+ |
|
mutant
S179R |
|
2,1 |
[260] |
|
||
RLI |
P. furiosus |
Biogénèse du ribosome, formation du complexe de translation… |
1,9 |
[168] |
Avec Mg2+-ADP |
|
AMP-PNP, Adénosine 5’(b-g-imido) triphosphate, LPS, lipopolysaccharide ; Vi,
vanadate inorganique.
Figure 16. Structure du domaine liant les nucléotides HisP en présence
d’ATP [145].
Les hélices a sont représentées en jaune, les feuilles b en vert, la molécule d’ATP est représentée en
rouge.
Figure 17. Représentation des différentes
orientations relatives des domaines liant les nucléotides des protéines ABC.
(1) Structures cristallographiques de dimères de NBD de HisP (a), Rad50 (b) et MalK (c). L’ATP est figuré en bâtons rouges. (2) Schémas des orientations relatives des NBD des protéines ABC HisP, MalK, Rad50 et de l’ATPase ArsA, d’après [175]. S indique le motif Signature et P le motif Walker A.
Figure 18.
Représentation
schématique des interactions entre ATP-Mg2+ et les résidus du domaine
liant les nucléotides de HlyB [451].
Les résidus des motifs Walker A (en rouge) et Walker B (en rose), ainsi
que de la D-loop (en noir) et de la Q-loop (en marron) appartiennent à un
domaine liant les nucléotides (site cis) alors les résidus du motif Signature
(en bleu) appartiennent à l’autre domaine liant les nucléotides du dimère de
HlyB (site trans).
Figure 19.
Cycle catalytique d’un transporteur ABC d’après [129], cas d’un système d’export.
Etape 1 : le cycle de transport débute avec la liaison du substrat au niveau des TMD, un changement de conformation est transmis aux NBD, ce qui facilite la liaison des deux molécules d’ATP et diminue l’énergie de formation du dimère fermé.
Etape 2 : la liaison des deux molécules d’ATP entraîne la formation du dimère fermé et une diminution de l’affinité du site de liaison du substrat [129, 353]. Il est supposé que le substrat est relâché à cette étape.
Etape 3 : l’ATP est hydrolysé, cette hydrolyse semble initier le retour du transporteur à son état initial, avec un dimère ouvert, en déstabilisant le dimère fermé par des répulsions électrostatiques.
Etape 4 : libération de phosphate inorganique puis d’ADP et retour à une conformation ouverte du dimère.
Figure 20.
Représentation en ruban du système d’import de la vitamine B12 de E. coli,
d’après [213].
Le transporteur ABC complet BtuCD est composé de quatre sous-unités : deux NBD, BtuD, en vert et bleu, et deux domaines transmembranaires, BtuC, en rouge et jaune [214]. Deux molécules de cyclotétravanadate occupent les sites de liaison des nucléotides des deux NBD. L’orientation relative de BtuCD et BtuF, la protéine extracellulaire liant la vitamine B12 [34], faite manuellement, positionne les résidus conservés de BtuC et BtuF en face-à-face, et la molécule de vitamine B12 se situe ainsi au niveau de l’ouverture du canal formé par BtuC [213].
Figure 21. Modèle proposé pour le
transport du lipopolysaccharide par MsbA [345].
Les domaines liant les nucléotides de MsbA ne sont pas représentés. (A) Le lipopolysaccharide (LPS) se lie à l’hélice elbow (structure fermée). (B) Les têtes lipidiques du LPS s’insèrent dans la chambre formée par les hélices membranaires. (C) La protéine subit des changements de conformation suite à la liaison et l’hydrolyse de l’ATP. (D) Le LPS est situé au niveau de la membrane externe, comme observé dans la structure de MsbA de S. typhimurium.
Tableau 3. Transporteurs ABC impliqués dans la
résistance spécifique aux antibiotiques.
Transporteur |
Organisme |
Substrats |
Références |
Organismes producteurs
|
|
|
|
Ard1 |
S. capreolus |
A201A |
[20] |
AviABC1 - AviABC2 |
S. viridochromogenes
|
Avilamycine |
[435] |
BcrABC |
B. licheniformis
|
Bacitracine |
[321] |
Car(A) |
S. thermotolerans |
Carbomycine (M16) |
[381] |
DrrAB |
S. peuceticus |
Anthracyclines |
[171] |
Ert(X) |
S. erythraea |
Erythromycine ? (M14) |
[299] |
LmrB |
L. lactis |
Bactériocines |
[97] |
Lmr(C) |
S. lincolnensis |
Lincomycine (L) |
[317] |
Ole(B) |
S. antibioticus |
Oléandomycine (M14) |
[296] |
Ole(C) – Ole(C5) |
S. antibioticus |
Oléandomycine (M14) |
[351] |
Srm(B) |
S. ambofaciens |
Spiramycine (M16) |
[381] |
Tlr(C) |
S. fradiae |
Tylosine (M16) |
[359] |
TnrB |
S. longisporoflavus |
Tétronasine |
[209] |
Var(M) |
S. virginiae |
Virginiamycine (S) |
[172] |
Organismes non producteurs |
|
|
|
BcrAB |
E. faecalis
|
Bacitracine |
[233] |
DrrAB |
M. tuberculosis |
Anthracyclines |
[64] |
Lsa |
E. faecalis |
L, SA |
[388] |
MacB |
E. coli |
M14-15 |
[182] |
Msr(A) |
S. epidermidis |
M14-15,
SB |
[357] |
Msr(C) |
E. faecium |
M, SB |
[386] |
Msr(D) |
Streptococcus spp. |
M14-15-16 |
[74] |
Rv2686c - Rv2687c - Rv2688c |
M. tuberculosis |
Fluoroquinolones |
[306] |
Vga(A) |
S. aureus |
L, SA |
[9, 56] |
Vga(B) |
S. aureus |
S |
[8, 56] |
L, lincosamides ; M14, M15,
M16, macrolides à 14, 15 et 16 chaînons ; SA, SB,
streptogramines A et B ; ?, transporteur
supposé.
Tableau
4. Transporteurs ABC conférant une résistance
de type MDR.
Transporteur |
Organisme |
Substrats |
Références |
BmrA |
B. subtilis |
EtBr,
H33342, doxorubicine, 7-aminoactinomycin D |
[390] |
EfrAB |
E. faecalis |
CIP, NOR,
doxycycline, anthracyclines, ACR, DAPI, TPP+ |
[197] |
HorA |
L. brevis |
Iso-a-acids, novobiocine, EtBr, H33342 |
[366] |
LmrA |
L. lactis |
AM, C,
FQ, MLS, TC, vinca alkaloids,
anthracyclines, colchicine, EtBr, valinomycine, nigéricine, H33342 |
[417] |
Md1-Md2 |
M. hominis |
CIP, NOR, ACR, EtBr |
[338] |
Msr |
S. rochei F20 |
M, TC, doxorubicine |
[90] |
VcaM |
V. cholerae non-O1 |
CIP, NOR,
TC, anthracyclines, DAPI,
H33342 |
[144] |
YdaG-YdbA |
L. lactis |
EtBr, daunomycine |
[223] |
ACR, acriflavine ; AM, aminoglycosides ;
C, chloramphénicol ; CIP, ciprofloxacine ; DAPI, 4’,6-diamidino-2-phénylindole ; EtBr, bromure
d’éthidium ; FQ, fluoroquinolones ; H3342, Hoechst 33342 ; MLS, macrolides,
lincosamides et streptogramines ; NOR, norfloxacine ; S,; TC, tétracyclines ; TPP+: ion tétraphénylphosphonium.
A
B
Figure 22. Représentation
schématique des transporteurs de la famille MFS.
En (A), un transporteur à 12 segments transmembranaires et en (B) un transporteur à 14 TMS, d’après [336].
Tableau
5. Pompes d’efflux de la famille MFS conférant
une résistance spécifique.
|
Transporteur |
Organisme |
Substrats |
Références |
à 12 TMS |
|
|
|
|
|
Bcr |
E. coli |
Sulfonamide |
[26] |
|
CmlA |
P.
aeruginosa |
C |
[28] |
|
CmlA2 |
E.
aerogenes |
C |
[320] |
|
Flo |
S.
typhimurium, E.
coli |
C,
florfénicol |
[33, 437] |
|
LmrA |
S. lincolnensis |
Lincomycine |
[452] |
|
Mef(A) |
Streptocoques |
M14-15 |
[396] |
|
Ptr |
S. pristinaespiralis |
Pristinamycine |
[29] |
|
Tap |
M. tuberculosis |
TC |
[5] |
|
TetA-TetE, TetG, TetH ,
TetI, TetJ, TetZ |
Bactéries à Gram-négatif |
TC |
[63] |
|
TetV |
Mycobactéries |
TC |
[426] |
à 14 TMS |
|
|
|
|
|
TetK, TetL |
Bactéries à Gram-positif |
TC |
[63] |
|
VarS |
S. virginiae |
Virginiamycine S |
[196] |
C, chloramphénicol ; M14-15, macrolides à 14 et 15 chaînons ; TC, tétracyclines.
Tableau
6. Pompes d’efflux MDR de la famille MFS.
Transporteur |
Organisme |
Substrats |
Références |
|
à 12 TMS |
|
|
|
|
|
Blt |
B. subtilis |
FQ,
doxorubicine, EtBr, ACR, R6G, TPP+, spermidine |
[4, 440] |
|
Bmr |
B.
subtilis |
C, FQ, doxorubicin,
puromycin, EtBr, ACR, R6G, TPP+ |
[279, 282] |
|
Cme |
C. difficile |
ERY, EtBr, safranine O |
[193] |
|
Cmr |
C. glutamicum |
ERY, TC, puromycine, bléomycine |
[150] |
|
EmeA |
E. faecalis |
NOR, EtBr |
[154] |
|
EmrD |
E. coli |
CCCP, salicylate |
[289] |
|
Lde |
L. monocytogenes |
FQ, EtBr, ACR |
[111] |
|
LmrP |
L. lactis |
MLS, TC, daunomycine, EtBr, H33342, R123, TPP+ |
[322] |
|
MdfA (Cmr, CmlA) |
E. coli |
certains AM, C, ERY, FQ, TC, daunomycine, rifampicine, puromycine, EtBr, R6G, BZC, TPP+ |
[85] |
|
MdrL |
L. monocytogenes |
M, céfotaxime, EtBr, métaux lourds |
[244] |
|
MdtA |
L. lactis |
MLS, TC |
[316] |
|
NorA |
S. aureus |
FQ hydrophiles, EtBr, ACR, CET, TPP+, BZC |
[166, 283] |
|
NorB |
S. aureus |
FQ, EtBr, CET |
[406] |
|
PmrA |
S. pneumoniae |
FQ hydrophiles, EtBr, ACR |
[109] |
|
Tap |
M. fortuitum |
AM, TC |
[5] |
à 14 TMS |
|
|
|
|
|
BcrA |
B. cepacia |
NAL, TC |
[438] |
|
Bmr3 |
B. subtilis |
FQ, ACR, EtBr, TPP+ |
[293] |
|
EfpA |
M. smegmatis |
FQ, AQ |
[204] |
|
EmrB |
E. coli |
NAL, CCCP, thiolactomycine, tetrachlorosalicylanilide |
[217] |
|
LfrA |
M. smegmatis |
FQ hydrophiles, EtBr, ACR, certains AQ |
[210, 399] |
|
MdeA |
S. aureus |
Virginiamycine,
novobiocine, EtBr, BZC |
[140] |
|
P55 |
M. tuberculosis, M.
bovis |
AM, TC |
[385] |
|
QacA |
S. aureus |
AQ mono- et divalents,
chlorhexidine, CV, EtBr, R6G |
[256] |
|
QacB |
S. aureus |
AQ monovalent,
chlorhexidine, CV, EtBr, R6G |
[310] |
|
Rv1877 |
M. smegmatis |
ERY, TC, kanamycine, AQ |
[204] |
|
VceB |
V. cholerae |
M, NAL, FQ hydrophobes,
CCCP |
[70] |
ACR, acriflavine ; AM, aminoglycosides ; AQ, ammoniums quaternaires ; BZC, chlorure de benzalkonium ; C, chloramphénicol ; CCCP, chlorophénylhydrazone du mésoxazolonitrile ; CET: cétrimide ; CV, cristal violet ; ERY, érythromycine ; EtBr, bromure d’éthidium ; FQ, fluoroquinolones ; H33342, Hoechst 33342 ; M, macrolides ; MLS, macrolides-lincosamides-streptogramines ; NAL, acide nalidixique ; NOR, norfloxacine ; R123, rhodamine 123 ; R6G, rhodamine 6G ; TC, tétracyclines ; TPP+, bromure de tétraphénylphosphonium.
Figure 23 FIGURE
Glp
Tableau 7. Systèmes d’efflux de la famille RND.
Transporteur |
Organisme |
MFP |
OMF |
Substrats |
Références |
AcrB |
E. aerogenes |
AcrA |
TolC |
CIP, NOR, C, M, TC, ACR,
SDS, sels biliaires |
[331] |
AcrB |
E. coli |
AcrA |
TolC |
b-lactames, C, M, FQ, NAL, TC, RP, novobiocine, triclosan, EtBr, sels biliaires |
[295] |
AcrB |
H. influenzae |
AcrA |
|
ERY, RP, novobiocine, EtBr, CV |
[367] |
AcrB |
Klebsiella spp. |
AcrA |
|
CIP |
[247] |
AcrB |
S. typhimurium |
AcrA |
TolC |
FQ |
[288] |
AcrD |
E. coli |
|
|
AM |
[352] |
AcrF |
E. coli |
AcrE |
TolC |
b-lactames, C, M, NAL, FQ, TC, RP, novobiocine, triclosan, EtBr, sels biliaires |
[289] |
AdeB |
A. baumannii |
AdeA |
AdeC |
FQ |
[228] |
AmrB |
B. pseudomallei |
AmrA |
OprA |
AM, M |
[262] |
ArpB |
P. putida |
ArpA |
ArpC |
TC, C, carbenicilline, streptomycine, ERY, novobiocine |
[176] |
BmeB |
B. fragilis |
BmeA |
BmeC |
Certains céphèmes, peptides antimicrobiens,
acide fusidique, novobiocine, puromycine |
[411] |
BpeB |
B. pseudomallei |
BpeA |
OprB |
Gentamicine, streptomycine, ERY, ACR |
[49] |
CeoB |
B. cenocepacia |
CeoA |
OpcM |
CIP, C, TM, salicylate |
[270] |
CmeB |
C. jejuni |
CmeA |
CmeC |
b-lactames, FQ, ERY, C, RP, TC, EtBr, acridine orange, SDS, sels
biliaires |
[207, 333] |
EefB |
E. aerogenes |
EefA |
EefC |
C, CIP, NOR, ERY, TC,
doxycycline |
[243] |
EmhB |
P. fluorescens |
EmhA |
EmhC |
C, NAL |
[125] |
MdtB-MdtC |
E. coli |
MdtA |
TolC |
novobiocine, sels
biliaires, SDS |
[269] |
HefB |
H. pylori |
HefA |
HefC |
ERY, clindamycine, TC, pénicilline G, EtBr, novobiocine |
[190] |
MexB |
P. aeruginosa |
MexA |
OprM |
b-lactames, C, M, FQ, NAL, TC, RP, TM, novobiocine, SDS, CV, EtBr |
[329] |
MexD |
P. aeruginosa |
MexC |
OprJ |
b-lactames, C, M, FQ, TC, TM, CV, EtBr |
[328] |
MexF |
P. aeruginosa |
MexE |
OprN |
C, FQ, imipénèm, TM |
[183] |
MexI |
P. aeruginosa |
MexH |
OpmD |
NOR, EtBr, ACR, R6G |
[383] |
MexK |
P. aeruginosa |
MexJ |
OprM |
TC, ERY, triclosan |
[65] |
MexW |
P. aeruginosa |
MexV |
OprM |
FQ, TC, C, ERY, EtBr,
ACR |
[206] |
MexY |
P. aeruginosa |
MexX |
OprM |
AM, EtBr |
[255] |
MtrD |
N. gonnorhoeae |
MtrC |
MtrE |
CIP, M, TC, peptides antimicrobiens, sels
biliaires |
[116, 384] |
SdeB |
S. marcescens |
SdeA |
|
FQ, C, EtBr, SDS |
[189] |
SdeY |
S. marcescens |
SdeX |
|
ERY, TC, NOR, BZC, EtBr,
ACR, R6G |
[53] |
SmeB |
S. maltophilia |
SmeA |
SmeC |
AM, FQ |
[205] |
SmeE |
S. maltophilia |
SmeD |
SmeF |
TC, C, ERY, quinolones, EtBr |
[10] |
TbtB |
P. stutzeri |
TbtA |
TbtM |
Tributyltine, C, NAL,
sulfaméthoxazole |
[155] |
TtgB |
P. putida |
TtgA |
TtgC |
C, NAL, TC,
ampicilline |
[401] |
XepB |
P. gingivalis |
XepA |
XepC |
RP, puromycine,
EtBr, SDS |
[147] |
YerP |
B. subtilis |
- |
- |
Surfactine, EtBr,
ACR |
[409] |
YhiV |
E. coli |
YhiU |
TolC |
ERY, doxorubicine,
déoxycholate, CV, EtBr, R6G |
[289] |
ACR,
acriflavine ; AM, aminoglycosides ; BZC, chlorure de benzalkonium ; C,
chloramphénicol ; CIP, ciprofloxacine ; CV, cristal violet ; ERY, érythromycine
; EtBr, bromure d’éthidium ; FQ, fluoroquinolones ; M, macrolides ; NAL, acide nalidixique
; NOR, norfloxacine ; R6G, rhodamine 6G ; RP, rifampicine ; SDS, sel de sodium
de l’acide dodécyl sulfonique ; TC,
tetracyclines ; TM, triméthoprime.
Figure 24. Représentation
schématique d’un transporteur de la famille RND, d’après [336].
|
Figure 25.
Modèle proposé pour le complexe AcrB-TolC par Murakami et al. [267].
Les trois monomères de AcrB sont en bleu, vert et rose ; les trois monomères de TolC sont en rouge, orange foncé et orange clair.
Tableau
8. Systèmes d’efflux de la famille MATE.
Transporteur |
Organisme |
Substrats |
Références |
BexA |
B. thetaiotaomicron |
CIP, NOR,
EtBr |
[257] |
CdeA |
C. difficile |
FQ, EtBr, ACR |
[82] |
HmrM |
H. influenzae |
NOR, DAPI,
anthracyclines, EtBr, TPP+, H33342, berbérine |
[443] |
MepA |
S. aureus |
Tigécycline, NOR, EtBr, TPP+,
DAPI |
[156, 248] |
NorE (YdhE) |
E. coli |
CIP, NOR, TPP+ |
[263, 445] |
NorM |
V. parahaemolyticus |
CIP, NOR, kanamycine, streptomycine, EtBr |
[40, 263] |
NorM |
Neisseria spp. |
ACR, EtBr, berbérine |
[361] |
PmpM |
P. aeruginosa |
FQ, ACR, BZC, EtBr, TPP+ |
[124] |
VcmA |
V. cholerae
non-O1 |
FQ, anthracyclines, streptomycine, kanamycine, EtBr, DAPI, H33342, ACR |
[143] |
VcrM |
V. cholerae non-O1 |
ACR,
DAPI, H33342, R6G, EtBr, TPP+ |
[142] |
VmrA |
V. parahaemolyticus |
ACR, DAPI, EtBr, TPP+ |
[55] |
ACR, acriflavine ; BZC, chlorure de benzalkonium ; CIP, ciprofloxacine ; DAPI, 4’,6-diamidino-2-phénylindole ; EtBr, bromure d’éthidium ; FQ, fluoroquinolones ; H33342, Hoechst 33342 ; NOR, norfloxacine ; QAC, ammoniums quaternaires ; R6G, rhodamine 6G ; TPP+, bromure de tétraphénylphosphonium.
Tableau 9. Systèmes d’efflux de la famille SMR.
Transporteur |
Organisme |
Substrats |
Références |
EbrA-EbrB |
B. subtilis |
EtBr,
ACR, pyronine Y, safranine O |
[242] |
EmrE |
E. coli |
EtBr, ACR |
[446] |
EmrE |
P. aeruginosa |
EtBr, ACR, AM hydrophiles |
[203] |
Mmr |
M. tuberculosis |
ERY, EtBr,
ACR, TPP+, pyronine Y, safranine O |
[77] |
QacE |
Bactéries à Gram-négatif |
Sulfonamides, EtBr, AQ |
[188] |
QacEΔ1 |
Bactéries à Gram-négatif |
Sulfonamides, CIP,
gentamicine, TC, EtBr, AQ |
[188] |
QacG |
Staphylococcus spp. |
EtBr, AQ |
[126] |
QacH |
S. saprophyticus |
EtBr, AQ |
[126] |
Smr (QacC/Ebr/QacD) |
S. aureus |
EtBr, AQ, TPP+ |
[308] |
YkkC-YkkD |
B. subtilis |
C, TC, streptomycine, EtBr, TPP+,
pyronine Y |
[148] |
ACR, acriflavine ; AM, aminoglycosides ; AQ, ammoniums quaternaires ; C, chloramphénicol ; CIP, ciprofloxacine ; ERY, érythromycine ; EtBr, bromure d’éthidium ; TC, tétracyclines ; TPP+, bromure de tétraphénylphosphonium.
Figure 26. Représentation
schématique d’un transporteur de la famille SMR, d’après [336].
Figure 27. Représentation
en ruban de
EmrE [227].
Quatre protéines EmrE (en bordeaux, gris, bleu et vert) forment un tétramère : le système de transport est composé de deux hétérodimères, chacun contenant deux protéine EmrE de conformations différentes. Le résidu Glu14 (TMS 1) est représenté en sphères rouges. N, extrémité N-terminale, C, extrémité C-terminale.
Vers
TolC
Figure 28.
Coupe de la structure de AcrB d’après [218].
La cavité centrale du transporteur située à la base du périplasme est accessible aux substrats à partir du cytoplasme et depuis le périplasme ; les substrats sont ensuite efflués vers TolC.
Tableau
10. Pompes d’efflux touchant les
fluoroquinolones.
Organisme |
Pompe |
Substrats |
Famille |
Spécificité |
Références |
Bactéries à Gram positif |
|
|
|
|
|
B. subtilis |
Blt |
FQ |
MFS |
MDR |
[4, 440] |
Bmr |
FQ |
MFS |
MDR |
[279, 282] |
|
Bmr3 |
FQ |
MFS |
MDR |
[293] |
|
E. faecalis |
EfrAB |
CIP, NOR |
ABC |
MDR |
[197] |
EmeA |
NOR |
MFS |
MDR |
[154] |
|
L. lactis |
LmrA |
FQ |
ABC |
MDR |
[417] |
L. monocytogenes |
Lde |
FQ |
MFS |
MDR |
[111] |
S. aureus |
NorA |
FQ hydrophiles |
MFS |
MDR |
[166, 283] |
S. pneumoniae |
PmrA |
FQ hydrophiles |
MFS |
MDR |
[109] |
Bactéries à Gram négatif |
|
|
|
|
|
A. baumannii |
AdeB |
FQ |
RND |
MDR |
[228] |
B. cenocepacia |
CeoB |
CIP |
RND |
MDR |
[270] |
B. thetaiotaomicron |
BexA |
CIP, NOR |
MATE |
MDR |
[257] |
C. difficile |
CdeA |
FQ |
MATE |
MDR |
[82] |
C. jejuni |
CmeB |
FQ |
RND |
MDR |
[207, 333] |
E. aerogenes |
AcrB |
CIP, NOR, |
RND |
MDR |
[331] |
E. coli |
MdfA (Cmr, CmlA) |
FQ |
MFS |
MDR |
[85] |
AcrB |
FQ |
RND |
MDR |
[295] |
|
AcrF |
FQ |
RND |
MDR |
[289] |
|
NorE (YdhE) |
CIP, NOR |
MATE |
MDR |
[263, 445] |
|
H. influenzae |
HmrM |
NOR |
MATE |
MDR |
[443] |
Klebsiella spp. |
AcrB |
CIP |
RND |
MDR |
[247] |
N. gonnorhoeae |
MtrD |
CIP |
RND |
MDR |
[116] |
P. aeruginosa |
MexB |
FQ |
RND |
MDR |
[329] |
MexD |
FQ |
RND |
MDR |
[328] |
|
MexF |
FQ |
RND |
MDR |
[183] |
|
MexI |
NOR |
RND |
MDR |
[383] |
|
MexW |
FQ |
RND |
MDR |
[206] |
|
PmpM |
FQ |
MATE |
MDR |
[124] |
|
S. maltophilia |
SmeB |
FQ |
RND |
MDR |
[205] |
SmeE |
quinolones |
RND |
MDR |
[10] |
|
S. marcescens |
SdeY |
NOR |
RND |
MDR |
[53] |
S. typhimurium |
AcrB |
FQ |
RND |
MDR |
[288] |
V. cholerae |
VceB |
FQ hydrophobes |
MFS |
MDR |
[70] |
V. cholerae non-O1 |
VcaM |
CIP, NOR |
ABC |
MDR |
[144] |
VcmA |
FQ |
MATE |
MDR |
[143] |
|
V. parahaemolyticus |
NorM |
CIP, NOR |
MATE |
MDR |
[40, 263] |
Bactéries à
Gram positif et négatif |
QacEΔ1 |
CIP |
SMR |
MDR |
[188] |
Mycobactéries |
|
|
|
|
|
M. tuberculosis |
Rv2686c - Rv2687c - Rv2688c |
FQ |
ABC |
Spécifique |
[306] |
M. smegmatis |
EfpA |
FQ |
MFS |
MDR |
[204] |
LfrA |
FQ hydrophiles |
MFS |
MDR |
[210, 399] |
|
Mycoplasmes |
|
|
|
|
|
M. hominis |
Md1-Md2 |
CIP, NOR |
ABC |
MDR |
[338] |
Tableau
11. Pompes d’efflux touchant les macrolides,
lincosamides et streptogramines chez les organismes producteurs.
Organisme |
Transporteur |
Antibiotique |
Famille |
Références |
S. thermotolerans |
Car(A) |
Carbomycine (M16) |
ABC II |
[381] |
S.
erythraea |
Ert(X) |
Erythromycine ? (M14) |
ABC II |
[299] |
S.
antibioticus |
Ole(B) |
Oléandomycine (M14) |
ABC II |
[296] |
OleC – OleC5 |
ABC I |
[351] |
||
S. ambofaciens |
Srm(B) |
Spiramycine (M16) |
ABC II |
[381] |
S. fradiae |
Tlr(C) |
Tylosine (M16) |
ABC II |
[359] |
S.
lincolnensis |
Lmr(C) |
Lincomycine (L) |
ABC II |
[317] |
Lmr(A) |
MFS |
[452] |
||
S. pristinaespiralis |
Ptr |
Pristinamycine (S) |
MFS |
[29] |
S. virginiae |
Var(M) |
Virginiamycine (S) |
ABC II |
[172] |
Var(S) |
Virginiamycine S (SB) |
MFS |
[196] |
M14, M16, macrolides à 14 et 16 chaînons ; L, lincosamides ; S, streptogramines ; SB, streptogramines B ; ABC I, ABC II, transporteur ABC de type I ou II ; MFS, transporteur de la famille MFS ; ?, transporteur supposé.
Figure 29. Arbre
phylogénétique simplifié des protéines ABC de type II, d’après [347].
Orf5 réfère à Msr(D) ; la protéine UvrA (E. coli) impliquée dans la réparation de l’ADN a été incluse pour comparaison.
Tableau
12. Autres pompes d’efflux touchant les
macrolide, lincosamides et streptogramines.
Organisme |
Pompe |
Substrats |
Famille |
Spécificité |
Références |
Bactéries à Gram positif |
|
|
|
|
|
E. faecalis |
Lsa |
L, SA |
ABC II |
Spécifique |
[388] |
E. faecium |
Msr(C) |
M, SB |
ABC II |
Spécifique |
[386] |
L. lactis |
LmrP |
MLS |
MFS |
MDR |
[322] |
L. lactis |
MdtA |
MLS |
MFS |
MDR |
[316] |
L. monocytogenes |
MdrL |
M |
MFS |
MDR |
[244] |
S. aureus |
MdeA |
S |
MFS |
MDR |
[140] |
S. aureus |
Vga(A) |
L, SA |
ABC II |
Spécifique |
[9] |
S. aureus |
Vga(B) |
S |
ABC II |
Spécifique |
[8] |
S. epidermidis |
Msr(A) |
M14-15,
SB |
ABC II |
Spécifique |
[357] |
Streptococcus spp. |
Mef(A) |
M14-15 |
MFS |
Spécifique |
[396] |
Streptococcus spp. |
Msr(D) |
M14-15-16 |
ABC II |
Spécifique |
[74] |
S. rochei F20 |
Msr |
M |
ABC |
MDR |
[90] |
Bactéries à Gram négatif |
|
|
|
|
|
B. pseudomallei |
AmrB |
M |
RND |
MDR |
[262] |
B. pseudomallei |
BpeB |
ERY |
RND |
MDR |
[49] |
C. glutamicum |
Cmr |
ERY |
MFS |
MDR |
[150] |
C. jejuni |
CmeB |
ERY |
RND |
MDR |
[207, 333] |
E. aerogenes |
AcrB |
M |
RND |
MDR |
[331] |
E. coli |
AcrB |
M |
RND |
MDR |
[295] |
E. coli |
AcrF |
M |
RND |
MDR |
[289] |
E. coli |
MacB |
M14-15 |
ABC |
Spécifique |
[182] |
E. coli |
MdfA (Cmr, CmlA) |
ERY |
MFS |
MDR |
[85] |
E. coli |
YhiV |
ERY |
RND |
MDR |
[289] |
H. influenzae |
AcrB |
ERY |
RND |
MDR |
[367] |
N. gonnorhoeae |
MtrD |
M |
RND |
MDR |
[116] |
P. aeruginosa |
MexB |
M |
RND |
MDR |
[329] |
P. aeruginosa |
MexD |
M |
RND |
MDR |
[328] |
P.
aeruginosa |
MexK |
ERY |
RND |
MDR |
[65] |
P. aeruginosa |
MexW |
ERY |
RND |
MDR |
[206] |
P. putida |
ArpB |
ERY |
RND |
MDR |
[176] |
S. maltophilia |
SmeE |
ERY |
RND |
MDR |
[10] |
S. marcescens |
SdeY |
ERY |
RND |
MDR |
[53] |
V. cholerae |
VceB |
M |
MFS |
MDR |
[70] |
Mycobactéries |
|
|
|
|
|
M. smegmatis |
Rv1877 |
ERY |
MFS |
MDR |
[204] |
M. tuberculosis |
Mmr |
ERY |
SMR |
MDR |
[77] |
ABC II, transporteur ABC de type II ; ERY, érythromycine (M14) ; M14, M15, M16, macrolides à 14, 15 et 16 chaînons ; L, lincosamides ; SA, SB, streptogramines de type A et B.
Figure 30.
Structures d’une tétracycline, la doxycycline, et d’un dérivé 13-thio de la
tétracycline, le 13-cyclopentylthio-tétracycline, qui est un inhibiteur de la
pompe d’efflux Tet(B).
Figure 31. Inhibiteurs connus des systèmes d’efflux eucaryotes.
Figure 32.
Structures des inhibiteurs les plus efficaces de la pompe NorA identifiés par
Markham et al. [240].
Figure 33. Structures
d’une phénothiazine, la chlorpromazine, et de deux phénylpipéridines
inhibiteurs sélectifs de la capture de la sérotonine, le paroxétine (actif) et
le fémoxétine (inactif).
Figure 34. Structures
d’inhibiteurs naturels de la pompe NorA.
Figure 35.
Structures d’inhibiteurs de pompes d’efflux de la famille RND.
Un criblage de composés synthétiques a permis d’identifier le dipeptide amide, PAbN (1), comme IPE de pompes RND. A partir de ce squelette peptidique, des efforts pour améliorer sa stabilité aux protéases ont conduit à (2) qui a deux acides aminés D. La synthèse d’analogues a abouti à la molécule (3) qui est moins toxique que (4).
D’autres molécules, qui ne contiennent pas ce squelette peptidique, telles le benzimidazole (5) ou l’arylpipérazine (6), peuvent aussi agir comme IPE de systèmes RND.
Figure 36.
Structures de quinolines utilisées comme inhibiteurs des systèmes RND.
Partant d’une pyridoquinoline (6), la synthèse d’analogues a montré que des composés 4-substitués, comme des thioalkyl- (7), alkylamino- (8) et alkoxy-quinolines (9) sont des inhibiteurs efficaces des transporteurs RND.
Figure 37.
Conception rationnelle et amélioration d’inhibiteurs spécifiques du système
MexAB-OprM de P. aeruginosa.
Partant de la molécule tête de série (10), les caractéristiques clés pour l’inhibition des pompes d’efflux ont été identifiées. Ceci a permis la conception de (11), bâtie sur un squelette pyridopyrimidine qui respecte ces critères et qui a de meilleures propriétés physico-chimiques que (10). Grâce à des études de relation structure-activité, ce squelette a encore été optimisé, conduisant au puissant IPE (12). Comme cette molécule est peu stable, des modifications chimiques supplémentaires ont été apportées, aboutissant à la molécule (13).
Figure 38.
Inhibiteurs des pompes d’efflux de type ABC.
Figure 39. Structures de substrats de la pompe d’efflux NorA.
Figure 40. Structures d’inhibiteurs de pompes d’efflux
utilisés dans cette étude.
Figure 41. Robot Biomek 2000 installé au laboratoire.
Tableau
13. Composition du milieu de conservation des
souches.
|
Pour 200 ml de milieu |
Infusion de cœur cervelle |
7,4 g |
Glycérol |
30 ml |
Eau distillée q.s.p. |
170 ml |
Après mélange, le milieu est stérilisé 15 min à 120°C, puis réparti en tubes de 1 ml.
Tableau
14. Composition du milieu de Mueller Hinton (MH)a.
|
Pour 1 litre de milieu |
Infusion de viande de boeuf |
300 ml |
Hydrolysat de caséine |
17,5 g |
Amidon |
1,5 g |
Eau distillée q.s.p. |
1000 ml |
pH |
7,3 ± 0,1 |
a La composition des milieux gélosés est identique à part la présence d’agar purifié à 10 g/l.
Tableau
15. Composition du milieu de Luria-Bertani (LB).
|
Pour 1 litre de milieu |
Bacto-Tryptone |
10 g |
Extrait de levure |
5 g |
NaCl |
10 g |
Eau distillée q.s.p. |
1000 ml |
pH (ajusté avec NaOH) |
7 |
Tableau 16. Composition du milieu M17a.
|
Pour 1 litre de milieu |
Digestion pancréatique de caséine |
5,0 g |
Peptone de soja |
5,0 g |
Extrait de bœuf |
5,0 g |
Extrait de levure |
2,5 g |
Acide ascorbique |
0,5 g |
Sulfate de magnésium |
0,25
g |
β-glycérophosphate disodique |
19,0
g |
pH |
6,9 ± 0,2 |
Eau distillée q.s.p. |
950
ml |
Lactose à 10% |
50 ml |
a La composition
des milieux gélosés est identique à part la présence d’agar purifié à 10 g/l.
Figure 42. Représentation
schématique du vecteur plasmidique pBAD/Myc-HisA (Invitrogen).
colE1, origine de réplication de E. coli ; araC, gène codant la protéine régulatrice AraC ; pBAD, promoteur de l’opéron arabinose de E. coli ; ATG, codon d’initiation ; MCS, site de clonage multiple ; myc, gène codant l’épitope Myc (Glu-Gln-Lys-Leu-Ile-Ser-Glu-Glu-Asp-Leu) ; (His)6, étiquette polyhistidine ; T, terminateur ; ampR, gène de résistance à l’ampicilline.
FICHE DE DONNEES
Numéro attribué |
573-01-ND230B |
Masse pesée |
10,8 mg |
Opérateur Poste tél |
Nicolas 76744 |
Structure de la molécule
|
Nom de la molécule (ou référence) |
ND 230b |
Formule brute |
C21H32N2O4Si |
Masse molaire |
404,58 |
Famille |
b-lactames |
Libre ou Brevetée (L ou B ou ?) |
Libre |
Stock restant |
OK |
Solubilité DMSO |
OK |
Commentaires
(stabilité, pureté, synthèse, autre solvant…) |
Figure 43. Exemple d’une fiche de données d’une molécule entrant dans la Chimiothèque.
Figure 44. CMI
de la molécule A en fonction de la concentration en antibiotique :
isobologrammes de l’association molécule A/antibiotique.
En vert, cas d’une association synergique entre les molécules, en rose cas d’un effet additif et en bleu, cas d’un antagonisme.
Figure 45. Schéma du protocole suivi lors des expériences d’accumulation de la ciprofloxacine.
Tableau
17. Composition des tampons utilisés pour les
techniques de biologie moléculaire.
Composants |
|
Concentration |
Tampon TAE |
|
|
Tris |
|
40 mM |
Acide acétique |
|
5 mM |
EDTA |
|
1 mM |
pH 7,8 |
|
|
|
|
|
Tampon TBE |
|
|
Tris |
|
90 mM |
Acide borique |
|
90 mM |
EDTA |
|
2 mM |
pH 8 |
|
|
Tableau
18. Composition des tampons utilisés pour l’extraction
de l’ADN plasmidique.
Composants |
|
Concentration |
Tampon de lyse |
|
|
Glucose |
|
50 mM |
Tris-HCl pH 8 |
|
25 mM |
EDTA pH 8 |
|
10 mM |
|
|
|
Solution de
lyse |
|
|
NaOH |
|
0,2 N |
SDS |
|
1 % |
|
|
|
Tampon de
précipitation |
|
|
Acétate de potassium |
|
3 M |
Acide acétique pH 4,8 |
|
5 M |
Tableau
19. Séquence des amorces utilisées pour
l’amplification du gène msr(A).
Nom |
Séquence |
Taille (nt) |
Tm (°C) |
msrABADA1 |
5’-GTG CTC GAG AAT GGA ACA ATA TAC AAT TAA-3’ |
30 |
48 |
msrABADA2 |
5’-GTT CTG CAG AGT TAT ATC ATG AAT AGA TTG-3’ |
30 |
52 |
Les séquences soulignées correspondent aux sites de restriction des enzymes XhoI ou PstI.
Tableau
20. Tampons utilisés pour la préparation de
bactéries compétentes par choc thermique.
Composants |
|
Concentration |
Tampon TFB1
|
|
|
KCl |
|
30 mM |
CaCl2 |
|
10 mM |
MnCl2 |
|
50 mM |
RbCl |
|
100 mM |
Glycérol |
|
15% |
pH 5,8 |
|
|
|
|
|
Tampon TFB2
|
|
|
MOPS1 |
|
10 mM |
CaCl2 |
|
75 mM |
RbCl |
|
10 mM |
Glycérol |
|
15% |
pH ajusté à 6,5 avec KOH 1M |
|
Les tampons sont filtrés sur filtre Millipore 0,22 µM.
1 MOPS : acide 3-(N-morpholino)
propane sulfonique.
Tableau
21. Séquence des amorces utilisées pour le
séquençage.
Nom |
Séquence |
msrABADA1 |
5’-GTG CTC GAG AAT GGA ACA ATA TAC AAT TAA-3’ |
msrABADA2 |
5’-GTT CTG CAG AGT TAT ATC ATG AAT AGA TTG-3’ |
msrA1 |
5’-ATG AAC CTA CAA ATC ACT TGG-3’ |
msrA2 |
5’-GAA TGG AAC ATT TGG AAG AAG-3’ |
msrA3 |
5’-TGA AGC ACT TGA GCG TTC TTG-3’ |
Tableau
22. Composition du gel de séquence.
Réactifs |
Volumes |
Solution concentrée d’acrylamide/bis-acrylamide + uréea |
50 ml |
TEMED |
35 µl |
Persulfate d’ammonium 10% |
250 µl |
a Concentrations finales : acrylamide 4,25 % et urée 6 M en tampon TBE |
A B
Traitement
informatique de la séquence
Figure 46. Exemple
d'un gel de séquençage et d'un électrophorégramme.
L’image de la migration électrophorétique des produits d’extension (A) est traitée à l’aide du logiciel « Sequencing Analysis 3.3 » afin de déterminer la séquence nucléotidique du produit de chaque piste (B).
Tableau
23. Composition du tampon échantillon.
Composants (pour 8 ml de tampon) |
V (ml) |
Eau distillée |
4 |
Tris 0,5 M pH 6,8 |
1 |
Glycérol |
0,8 |
SDS 10% (p/v) |
1,6 |
2-b mercaptoéthanol |
0,4 |
Bleu de bromophénol 0,05% (p/v) |
0,2 |
Tableau
24. Composition des gels de séparation (12%) et
de concentration (4%).
Composants (pour 10 ml de gel) |
12% |
4% |
Eau distillée |
3,35 ml |
6,1 ml |
Tris 1,5 M pH 8,8 |
2,5 ml |
- |
Tris 0,5 M pH 6,8 |
- |
2,5 ml |
SDS 10% (p/v) |
100 µl |
100 µl |
Acrylamide/Bis-acrylamide (37,5/1) |
4 ml |
1,3 ml |
Persulfate d’ammonium 10% |
50 µl |
50 µl |
TEMED |
5 µl |
10 µl |
Tableau
25. Composition du tampon de migration, pH 8,3.
Composants |
|
Tris |
25 mM |
Glycine |
0,2 M |
SDS |
0,1% |
Tableau
26. Protéines utilisées pour la construction
par homologie du modèle de la protéine Msr(A).
Protéines
utilisées |
Code
PDB |
Références |
ArsA |
1IHU |
[456] |
BtuCD |
1L7V |
[214] |
CFTR |
1R0X |
[199] |
GlcV |
1OXX |
[421] |
HisP |
1B0U |
[145] |
HlyB |
1MTO |
[377] |
MalK |
1Q12 |
[54] |
MJ0796 |
1L2T |
[389] |
Rad50 |
1F2U |
[137] |
TAP1 |
1JJ7 |
[102] |
MEQYTIKFNQINHKLTDLRSLNIDHLYAYQFEKIALIGGNGTGKTTLLNMIAQKTKPESG
TVETNGEIQYFEQLNMDVENDFNTLDGSLMSELHIPMHTTDSMSGGEKAKYKLANVISNY
SPILLLDEPTNHLDKIGKDYLNNILKYYYGTLIIVSHDRALIDQIADTIWDIQEDGTIRV
FKGNYTQYQNQYEQEQLEQQRKYEQYISEKQRLSQASKAKRNQAQQMAQASSKQKNKSIA
PDRLSASKEKGTVEKAAQKQAKHIEKRMEHLEEVEKPQSYHEFNFPQNKIYDIHNNYPII
AQNLTLVKGSQKLLTQVRFQIPYGKNIALVGANGVGKTTLLEAIYHQIEGIDCSPKVQMA
YYRQLAYEDMRDVSLLQYLMDETDSSESFSRAILNNLGLNEALERSCNVLSGGERTKLSL
AVLFSTKANMLILDEPTNFLDIKTLEALEMFMNKYPGIILFTSHDTRFVKHVSDKKWELT
GQSIHDIT
Figure 47. Séquence d’acides aminés de la protéine Msr(A) [357].
Les motifs Walker A et B du NBD N-terminal sont en caractères rouges gras, le motif Signature de ce domaine est souligné en rose ; les mêmes séquences dans le domaine C-terminal sont en bleu et turquoise. Les résidus glutamine du Q-linker sont en vert.
Figure 48. Exemple
de code attribué aux molécules de la Chimiothèque.
Il s’agit de la molécule non brevetée de l’équipe 01 de l’UMR CNRS 7573, située dans la plaque n°12 et en position F09. Cette molécule se trouve dans la plaque n° 573-01-12.
Figure 49. Fiche
d’enregistrement d’une molécule dans la base de données.
Les informations relatives à la molécule (structure, identificateurs…) sont entrées dans la base lors de la mise en plaque des produits ; les résultats de criblage (en bas) sont renseignés au fur et à mesure. Les résultats des tests sur les souches sensibles (souches ATCC de E. coli et S. aureus) figurent dans les cases rouges bilan ; dans le cas de molécules actives, les cases CMI sont également remplies. Les résultats des tests en présence d’antibiotique sur les deux souches résistantes de S. aureus étudiées sont également entrés dans la base (cases roses).
Tableau 27. CMI de différents antibiotiques vis-à-vis
des souches sensibles de référence, déterminées avec le Biomek 2000.
|
CMI (mg/ml) |
||||||||||
Antibiotiques |
E. coliATCC 25922 |
P. aeruginosa
ATCC
29653 |
S. aureus
ATCC
25923 |
E. faecalis
ATCC 29212 |
|||||||
réfa |
expb |
|
réf |
exp |
|
réf |
exp |
|
réf |
exp |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Ampicilline |
2 - 8 |
8 |
|
- |
ndc |
|
0,25 - 1 |
0,5 |
|
0,5 - 2 |
4 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
CIP |
0,004 - 0,015 |
0,003 |
|
0,25 - 1 |
0,5 |
|
0,12 - 0,5 |
0,25 |
|
0,25 - 2 |
2 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
ERY |
- |
nd |
|
- |
nd |
|
0,12 - 0,5 |
0,25 |
|
1 - 4 |
1 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Gentamicine |
0,25 - 1 |
0,5 |
|
0,5 - 2 |
1 |
|
0,12 - 1 |
0,5 |
|
4 - 16 |
8 |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
Tétracycline |
1 - 4 |
2 |
|
8 - 32 |
32 |
|
0,12 - 1 |
0,5 |
|
8 - 32 |
16 |
a CMI de référence (d’après [11]) ; b Moyenne des CMI déterminées par le Biomek 2000 et réalisées en triplicate ; c Non déterminé, résistance naturelle.
Figure 50. Courbes
de croissance de E. coli ATCC 25922 (dilution initiale de
l’inoculum au 1/100ème), en fonction du temps en présence de
différentes concentrations en DMSO, 0%, 1%, 5% et 10%.
Figure 51. Courbes
de croissance de S. aureus ATCC 25923 en fonction du temps en
présence de milieu MH seul, de MH + DMSO à 1% (témoin négatif), d’ampicilline à
16 µg/ml (témoin positif), et de quatre molécules testées à 100 µg/ml, appelées
A, B, C et D. Ces quatre molécules représentent les exemples les plus typiques
de courbes obtenues pour les molécules testées.
|
01 |
02 |
03 |
04 |
05 |
06 |
07 |
08 |
09 |
10 |
11 |
12 |
A |
|
|
|
|
|
|
|
|
+ |
|
|
|
B |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
C |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
++ |
|
|
D |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
++ |
|
E |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
+ |
|
F |
|
|
|
|
|
|
|
|
|
|
+ |
|
G |
|
|
|
|
|
|
|
|
++ |
++ |
|
|
H |
|
++ |
|
|
|
|
|
|
|
++ |
|
|
Figure 52. Présentation
des résultats d’une plaque de 80 molécules testées, obtenue après traitement
par le programme informatique.
Les cases jaunes correspondent aux molécules inactives, les cases oranges aux molécules peu actives (+), et enfin les cases rouges aux molécules actives (++).
Figure 53.
Répartition des molécules actives (155) vis-à-vis de S. aureus ATCC
25923 en fonction de leur CMI.
|
R1 |
R2 |
R3 |
CMI (µg/ml) |
Vibrindole |
CH3 |
H |
H |
12,5 |
|
CF3 |
H |
H |
6 |
|
CF2Cl |
H |
H |
6 |
|
CH3 |
Br |
Br |
1,5 |
|
CH2CH3 |
Br |
Br |
3 |
|
CF3 |
Br |
Br |
1,5 |
|
CF2Cl |
Br |
Br |
1,5 |
|
CF3 |
F |
F |
3 |
|
CF3 |
NO2 |
NO2 |
1,5 |
|
CF3 |
H |
Br |
1,5 * |
|
CF3 |
H |
Me |
5 |
|
CF3 |
COOMe |
COOMe |
50 |
|
CF3 |
H |
COOMe |
10 |
Figure 54. Comparaison
de l’activité d’analogues du vibrindole : CMI vis-à-vis de la souche de S. aureus ATCC 25923 en fonction des
substituants présents.
* Dans le cas d’une seule substitution par Br en
R3, la CMI est de 1,5 µg/ml quelque soit la position du substituant
sur le cycle.
Tableau
28. Résultats du criblage des extraits bruts du
Brésil à 100 µg/ml : activité antibactérienne sur les souches sensibles E.
coli et S. aureus ATCC, et une souche résistante, S. aureus
NorA.
Famille |
Genre et espèce |
Tissu |
E. coli ATCC 25922 |
S. aureus ATCC 25923 |
S. aureus NorA |
Anacardiacea |
Schinus
terebinthifolius |
Ecorce |
- |
+ |
+ |
Feuille |
- |
+ |
- |
||
Annonaceae |
Annona
crassifolia |
Feuille |
- |
- |
- |
Graine |
- |
+ |
- |
||
Ecorce |
- |
- |
- |
||
Fruit |
- |
- |
+ |
||
Annona muricata |
Feuille |
- |
+ |
- |
|
Annona salzmanii |
Fruit |
- |
- |
- |
|
Apocynaceae |
Aspidosperma
cylindrocarpon |
Feuille |
- |
- |
- |
Condylocarpon
isthmicum |
Feuille |
- |
- |
- |
|
Tige |
- |
- |
- |
||
Himatanthus
obovatus |
Tige |
- |
- |
- |
|
Araliaceae |
Didymopanax
morototoni |
Bois |
- |
- |
- |
Asclepiadaceae |
Ditassa
crassifolia |
Feuille |
- |
- |
- |
Tige |
- |
- |
- |
||
Marsdenia
altissima |
Feuille |
- |
- |
- |
|
Tige |
- |
- |
- |
||
Asteraceae |
Senecio
jurgensenii |
Tige |
- |
- |
- |
Boraginaceae |
Auxemma
oncocalyx |
Bois |
- |
- |
- |
Cecropiacea |
Cecropia
pachystachya |
Racine |
- |
- |
nd |
Ecorce |
- |
- |
nd |
||
Tige |
- |
- |
nd |
||
Feuille |
- |
- |
nd |
||
Celastraceae |
Maytenus rigida |
Ecorce |
- |
- |
nd |
Feuille |
- |
- |
nd |
||
Euphorbiaceae |
Jatropha
elliptica |
Feuille |
- |
- |
- |
Rhizome |
- |
+ |
+ |
||
Fabaceae |
Andira inermis |
Feuille |
- |
- |
- |
Caesalpinia
pyramidalis |
Feuille |
- |
- |
- |
|
Tige |
- |
- |
- |
||
Copaifera spp. |
Huile |
- |
++a |
nd |
|
Dioclea virgata |
Feuille |
- |
- |
- |
|
Erythrina
mulungu |
Tige |
- |
- |
- |
|
Ecorce |
- |
- |
+ |
||
Erythrina
velutina |
Feuille |
- |
- |
- |
|
Pterodon
polygalaeflorus |
Tige |
- |
- |
- |
|
Ecorce |
- |
- |
- |
||
Racine |
- |
- |
- |
||
Feuille |
- |
- |
- |
||
Lauraceae |
Ocotea glomerata |
Feuille |
- |
- |
- |
Tige |
- |
- |
- |
||
Lythraceae |
Lafoensia pacari |
Feuille |
- |
- |
- |
Ecorce |
- |
+ |
++ |
||
Tige |
- |
- |
+ |
||
Myrtaceae |
Syzygium
jambolanum |
Racine |
- |
- |
- |
Olacaceae |
Ximenia
americana |
Feuille |
- |
- |
- |
Ecorce |
- |
- |
- |
||
Piperaceae |
Piper arboreum |
Feuille |
- |
- |
- |
Rhamnaceae |
Ziziphus joazeiro |
Feuille |
- |
- |
- |
Ecorce |
- |
- |
- |
||
Sapindaceae |
Cupania
oblongifolia |
Bois |
- |
- |
- |
Feuille |
- |
- |
- |
||
Cupania
platycarpa |
Bois |
- |
- |
- |
|
Ecorce |
- |
- |
- |
||
Magonia
pubescens |
Graine |
- |
- |
- |
|
|
|
|
|
|
(à suivre) |
Tableau 28. Résultats du criblage des extraits bruts du Brésil à 100 µg/ml. (suite) |
|||||
Famille |
Genre et espèce |
Tissu |
E. coli ATCC 25922 |
S. aureus ATCC 25923 |
S. aureus NorA |
Sapindaceae |
Serjania
lethalis |
Tige |
- |
+ |
+ |
Feuille |
- |
++b |
++ |
||
Talisia
esculenta |
Bois |
- |
- |
+ |
|
Simaroubacea |
Quassia amara |
Feuille |
- |
- |
- |
Simarouba amara |
Tige |
- |
- |
- |
|
Racine |
- |
- |
- |
||
Feuille |
- |
- |
- |
||
Sterculiaceae |
Guazuma
ulmifolia |
Ecorce |
- |
- |
- |
Verbenaceae |
Aegiphila
lhotskiana |
Tige |
- |
- |
- |
Feuille |
- |
- |
- |
||
Zingiberaceae |
Hedychium
coronarium |
Feuille |
- |
- |
- |
a CMI = 100 µg/ml ; b CMI = 64 µg/ml ; -, extrait inactif ; +, extrait peu actif ; ++, extrait actif ; nd, non déterminé. Les extraits bruts qui ont été purifiés par la suite sont en caractères gras. |
Figure 55. Schéma
général du procédé d’extraction et de purification des extraits naturels du
Brésil.
A partir de la matière sèche d’une partie de la plante, une percolation à l’éthanol permet d’obtenir l’extrait brut. Lorsqu’une activité biologique de l’extrait brut est détectée, une extraction à l’hexane, puis au méthanol et enfin à l’acétate d’éthyle est menée, conduisant respectivement aux fractions E-Hex, E-CHCl3, E-AcOEt et E-H2O. Si l’une de ces fractions se révèle active, elle est purifiée sur colonne, éventuellement en plusieurs étapes : à l’issue de la première colonne, les fractions C-solvanti sont obtenues ; si l’une de ces fractions est active, une seconde purification sur colonne, avec des conditions expérimentales éventuellement différentes, est réalisée, conduisant aux fractions CC-solvanti.
Tableau 29. Résultats
du criblage (à 100 µg/ml) des fractions obtenues après purification d’extraits
bruts de six plantes du Brésil.
Espèce et extraits |
|
|
S. aureus ATCC |
S. aureus NorA |
S. aureus NorA + CIP |
|||
Serjania lethalis |
|
|
|
|
|
|||
Tige |
Brut |
|
|
+ |
+ |
++ |
||
|
E-Hex |
|
|
- |
- |
- |
||
|
E-CHCl3 |
|
|
- |
- |
++ |
||
|
E-AcOEt |
|
|
++ |
++ |
++ |
||
|
E-H20 |
|
|
++ |
++ |
++ |
||
Feuilles |
Brut |
|
|
++b |
++ |
++ |
||
|
E-Hex |
|
|
- |
- |
- |
||
|
E-CHCl3 |
|
|
- |
- |
- |
||
|
E-AcOEt |
|
|
++ |
+ |
++ |
||
|
|
|
|
|
||||
Schinus terebenthifolius |
|
|
|
|
||||
Ecorce |
Brut |
|
|
+ |
+ |
+ |
||
|
E-Hex |
|
|
+ |
+ |
- |
||
|
E-CHCl3 |
|
- |
- |
++ |
|||
|
E-AcOEt |
|
- |
- |
- |
|||
|
E-H2O |
|
- |
- |
- |
|||
|
E-Hex / |
C-Hex/AcOEt 2,5% |
- |
nd |
- |
|||
|
|
C-Hex/AcOEt 5% |
|
- |
nd |
- |
||
|
|
C-Hex/AcOEt 10% |
|
- |
nd |
+ |
||
|
|
C-Hex/AcOEt
25% |
|
+ |
nd |
+ |
||
|
|
C-Hex/AcOEt
50% |
|
++ |
nd |
++ |
||
|
|
C-AcOEt |
|
- |
nd |
- |
||
|
|
C-MeOH |
|
- |
nd |
- |
||
|
|
|
|
|
|
|||
Jatropha
elliptica |
|
|
|
|
|
|||
Rhizome |
Brut |
|
|
+ |
+ |
++ |
||
|
Jatropholone |
|
- |
- |
- |
|||
|
Acide 3-O-acétyl aleuritolique |
|
- |
- |
- |
|||
|
Propacine |
|
|
- |
- |
+ |
||
|
F-(1-7) |
|
|
++a |
++ |
++ |
||
|
F-(8-15) |
|
|
- |
- |
- |
||
|
F-(16-21) |
|
|
- |
- |
++ |
||
|
F-(22-27) |
|
|
- |
- |
- |
||
|
|
|
|
|
|
|||
Annona
crassifolia |
|
|
|
|
|
|||
Graine |
Brut |
|
|
+ |
- |
++ |
||
|
E-CHCl3 |
|
- |
- |
++ |
|||
|
E-AcOEt |
|
- |
- |
+ |
|||
|
E-H2O |
|
|
- |
- |
- |
||
|
E-AcOEt / |
C-Hex/AcOEt 25% |
|
- |
nd |
++ |
||
|
|
C-Hex/AcOEt 50% |
|
- |
nd |
- |
||
|
|
C-Hex/AcOEt 70% |
|
- |
nd |
+ |
||
|
|
C-MeOH |
|
- |
nd |
++ |
||
|
|
C-AcOEt |
|
++ |
nd |
++ |
||
|
|
|
|
|
|
|||
Annona muricata |
|
|
|
|
|
|||
Feuille |
Brut |
|
|
+ |
- |
+ |
||
|
E-CHCl3 |
|
- |
- |
+ |
|||
|
E-AcOEt+EtOH |
|
- |
- |
- |
|||
|
E-H2O/EtOH (7/3) |
|
- |
- |
- |
|||
|
E-H2O/EtOH (1/1) |
|
- |
- |
++ |
|||
|
|
|
|
|
(à suivre) |
|||
Tableau 29. Résultats du criblage (à 100 µg/ml) des fractions obtenues après purification d’extraits bruts de six plantes du Brésil. (suite) |
||||||||
|
|
|
|
|
|
|||
Espèce et extraits |
|
|
S. aureus ATCC |
S. aureus NorA |
S. aureus NorA + CIP |
|||
Lafoensia
pacari |
|
|
|
|
|
|||
Ecorce |
Brut |
|
|
+ |
++ |
++ |
||
|
E-Hex |
|
|
- |
- |
- |
||
|
E-CHCl3 |
|
|
- |
- |
- |
||
|
E-AcOEt |
|
|
+ |
++ |
++ |
||
|
E-H2O |
|
|
+ |
++ |
++ |
||
|
E-AcOEt / |
C-CHCl3 |
|
- |
- |
- |
||
|
|
C-AcOEt |
|
- |
- |
- |
||
|
|
C-AcOEt/MeOH 10
% |
+ |
+ |
++ |
|||
|
|
C-MeOH |
|
- |
- |
- |
||
|
|
C-MeOH/H2O
10 % |
- |
- |
- |
|||
C-AcOEt/MeOH 10 % / |
CC-H2O |
- |
- |
- |
||||
|
|
|
CC-EtOH/H2O
|
- |
- |
- |
||
|
|
|
CC-EtOH |
- |
- |
- |
||
|
|
|
CC-AcOEt |
- |
- |
- |
||
|
|
|
CC-MeOH |
- |
- |
- |
||
a CMI = 100 µg/ml ; b CMI = 64 µg/ml ; -, extrait inactif ; +, extrait peu actif ; ++, extrait actif ; nd, non déterminé. Les fractions qui ont été purifiées par la suite sont en caractères gras. |
||||||||
Tableau
30. CMI des extraits bruts et des fractions
purifiées, vis-à-vis de la souche de S. aureus ATCC 25923.
Espèce et extraits |
|
CMI
(µg/ml) |
|
Copaifera spp. |
|
|
|
Huile |
Brut |
|
100 |
Schinus
terebenthifolius |
|
|
|
Ecorce |
Brut |
|
> 100 |
|
E-Hex/
C-Hex/AcOEt 50% |
|
64 |
|
E-Hex/ C-Hex/AcOEt 25% |
|
125 |
Annona crassifolia |
|
|
|
Graine |
Brut |
|
> 100 |
|
E-AcOEt / C-Ac0Et |
|
100 |
Jatropha elliptica |
|
|
|
Rhizome |
Brut |
|
> 100 |
|
F-(1-7) |
|
100 |
Serjania lethalis |
|
|
|
Tige |
Brut |
|
> 100 |
|
E-AcOEt |
|
100 |
|
E-H20 |
|
100 |
Feuilles |
Brut |
|
64 |
|
E-AcOEt |
|
100 |
Tableau
31. CMI de D06 et des analogues les plus actifs
vis-à-vis des souches sensibles de E. coli et S. aureus, et de
l’antibiotique témoin, l’ampicilline.
|
CMI (µg/ml) |
|
Molécules |
E. coli ATCC 25922 |
S. aureus ATCC 25923 |
Ampicilline |
8 |
0,5 |
126-01-02-L-D06 |
< 1,5 |
< 0,37 |
126-01-03-L-H02 |
6 |
0,75 |
126-01-03-L-G03 |
3 |
1,5 |
126-01-03-L-A06 |
6 |
1,5 |
126-01-03-L-E07 |
6 |
3 |
126-01-03-L-E06 |
12,5 |
3 |
126-01-05-L-E04 |
12,5 |
3 |
126-01-06-L-H07 |
12,5 |
3 |
126-01-05-L-G11 |
25 |
3 |
126-01-03-L-F02 |
25 |
3 |
126-01-05-L-D11 |
50 |
3 |
126-01-06-L-G08 |
50 |
3 |
126-01-06-L-D08 |
> 100 |
3 |
Figure 56. Répartition
de D06 et de ses analogues actifs (38 molécules), en fonction de leur CMI
vis-à-vis des souches sensibles de E. coli et S. aureus.
Tableau
32. Détermination de CMI d’antibiotiques
vis-à-vis des souches SA-1199, sensible, et SA-1199B, résistante.
|
CMI (µg/ml) |
||||
Composé |
SA-1199 |
|
SA-1199B |
||
réf |
exp |
|
réf |
exp |
|
CIP |
0,3 |
0,37 |
|
6 |
16 |
CIP + RES1 |
- |
0,37 |
|
- |
4 |
NOR |
1 |
1 |
|
64 |
64 |
NOR + RES |
0,5 |
0,75 |
|
8 |
24 |
PEF |
0,65 |
1 |
|
12,5 |
8 |
PEF + RES |
- |
nd |
|
- |
8 |
EtBr |
8 |
8 |
|
64 |
48 |
EtBr + RES |
2 |
nd |
|
8 |
12 |
ACR |
6,3 |
4 |
|
25 |
48 |
Cétrimide |
0,4 |
0,5 |
|
6,3 |
4 |
Chlorure de benzalkonium |
0,8 |
1 |
|
3,1 |
4 |
1 Réserpine à 20 µg/ml.
réf, CMI issues des références [161, 162, 165] ; exp, CMI expérimentale (moyenne de 3 CMI déterminées par le Biomek 2000) ; nd, non déterminé ; -, données non référencées.
Figure 57. Courbes
de croissance sur 24h de la souche résistante SA-1199B (A) et de la souche
sensible SA-1199 (B) : différents témoins sont réalisés.
Figure 58. Répartition
des inhibiteurs potentiels (126) de la pompe d’efflux NorA en fonction de leur
concentration qui permet de restaurer la CMI de CIP à 4 µg/ml vis-à-vis de la
souche de S. aureus NorA.
Le rouge représente les benzothiophènes, tels que G03, et les benzofuranes.
Figure 59. Isobologramme obtenu pour l’association G03 - CIP vis-à-vis de la souche de S. aureus NorA.
Tableau 33. Résultats du criblage des extraits bruts du
Brésil à 100 µg/ml sur la souche résistante de S. aureus NorA en association avec CIP, activité
antibactérienne sur la souche de S. aureus
NorA, et rappel de l’activité sur la souche sensible de S aureus ATCC 25923.
|
|
A |
B |
C |
Genre et espèce |
Tissu |
S. aureus NorA + CIP |
S. aureus NorA |
S. aureus ATCC 25923 |
Schinus terebinthifolius |
Ecorce |
+ |
- |
+ |
Feuille |
++ |
- |
+ |
|
Annona crassifolia |
Graine |
++ |
- |
+ |
Ecorce |
++ |
- |
- |
|
Fruit |
++ |
+ |
- |
|
Annona muricata |
Feuille |
+ |
- |
+ |
Aspidosperma cylindrocarpon |
Feuille |
++ |
- |
- |
Didymopanax morototoni |
Bois |
++ |
- |
- |
Auxemma oncocalyx |
Bois |
++ |
- |
- |
Cecropia pachystachya |
Racine |
++ |
- |
- |
Ecorce |
++ |
- |
- |
|
Tige |
++ |
- |
- |
|
Jatropha elliptica |
Rhizome |
++ |
+ |
+ |
Andira inermis |
Feuille |
++ |
- |
- |
Caesalpinia pyramidalis |
Feuille |
++ |
- |
- |
Tige |
++ |
- |
- |
|
Erythrina mulungu |
Tige |
++ |
- |
- |
Ecorce |
++ |
+ |
- |
|
Pterodon polygalaeflorus |
Tige |
++ |
- |
- |
Racine |
++ |
- |
- |
|
Ocotea glomerata |
Feuille |
++ |
- |
- |
Lafoensia pacari |
Ecorce |
++ |
++ |
+ |
Tige |
++ |
+ |
- |
|
Ximenia americana |
Ecorce |
++ |
- |
- |
Cupania oblongifolia |
Feuille |
++ |
- |
- |
Serjania lethalis |
Tige |
++ |
+ |
+ |
Feuille |
++ |
++ |
++ |
|
Simarouba amara |
Tige |
++ |
- |
- |
Aegiphila lhotskiana |
Tige |
++ |
- |
- |
Feuille |
++ |
- |
- |
Les extraits bruts marqués en rouge sont des inhibiteurs potentiels de la pompe d’efflux NorA ; les extraits qui ont été purifiés par la suite sont en caractères gras.
Tableau
34. Résultats du criblage des fractions obtenues
après purification d’extraits bruts de neuf plantes du Brésil en vue de la
recherche d’inhibiteurs de la pompe NorA.
Espèce et extraits |
|
|
S. aureus ATCC |
S. aureus NorA |
S. aureus NorA + CIP |
||||||||
Simarouba amara |
|
|
|
|
|
||||||||
Tige |
Brut |
|
|
- |
- |
++ |
|||||||
|
E-Hex |
|
|
- |
nd |
+ |
|||||||
|
E-CHCl3 |
|
|
- |
nd |
+ |
|||||||
|
E-AcOEt |
|
|
- |
nd |
+ |
|||||||
|
E-H2O |
|
|
- |
nd |
- |
|||||||
|
|
|
|
|
|
||||||||
Erythrina mulungu |
|
|
|
|
|
||||||||
Tige |
Brut |
|
|
- |
- |
++ |
|||||||
|
E-Hex |
|
|
- |
nd |
+ |
|||||||
|
E-CHCl3 |
|
|
- |
nd |
- |
|||||||
|
|
|
|
|
|||||||||
Didymopanax
morototoni |
|
|
|
|
|||||||||
Bois |
Brut |
|
|
- |
- |
++ |
|||||||
|
E-Hex |
|
|
- |
- |
- |
|||||||
|
E-CHCl3 |
|
|
- |
- |
- |
|||||||
|
E-AcOEt |
|
|
- |
- |
- |
|||||||
|
E-H2O |
|
|
- |
- |
- |
|||||||
|
E-
CHCl3/ |
C-Hex/ CHCl3 (1/1) |
|
- |
- |
- |
|||||||
|
|
C-Hex/ CHCl3 (1/2) |
|
- |
- |
- |
|||||||
|
|
C- CHCl3 |
|
- |
- |
- |
|||||||
|
|
C-CHCl3/MeOH |
|
- |
- |
- |
|||||||
|
|
C-CHCl3/MeOH
5% |
|
- |
- |
- |
|||||||
|
|
C-CHCl3/MeOH
10% |
- |
- |
- |
||||||||
|
|
C-MeOH |
|
- |
- |
- |
|||||||
|
|
|
|
|
|||||||||
Schinus terebenthifolius |
|
|
|
|
|||||||||
Ecorce |
Brut |
|
|
+ |
+ |
+ |
|||||||
|
E-Hex |
|
|
+ |
+ |
- |
|||||||
|
E-CHCl3 |
|
- |
- |
++ |
||||||||
|
E-AcOEt |
|
- |
- |
- |
||||||||
|
E-H2O |
|
- |
- |
- |
||||||||
|
|
|
|
|
|
||||||||
Jatropha elliptica |
|
|
|
|
|
||||||||
Rhizome |
Brut |
|
|
+ |
+ |
++ |
|||||||
|
Jatropholone |
|
- |
- |
- |
||||||||
|
Acide 3-O-acétyl aleuritolique |
|
- |
- |
- |
||||||||
|
Propacine |
|
|
- |
- |
+ |
|||||||
|
F-(1-7) |
|
|
++a |
++ |
++ |
|||||||
|
F-(8-15) |
|
|
- |
- |
- |
|||||||
|
F-(16-21) = composé B |
|
- |
- |
++ |
||||||||
|
F-(22-27) |
|
|
- |
- |
- |
|||||||
|
|
|
|
|
|
||||||||
Annona
crassifolia |
|
|
|
|
|
||||||||
Ecorce |
Brut |
|
|
- |
- |
++ |
|||||||
|
E-Hex |
|
- |
- |
- |
||||||||
|
E-Hex/CHCl3 |
|
- |
- |
- |
||||||||
|
E-CHCl3 |
|
|
- |
- |
- |
|||||||
|
E-MeOH |
|
|
- |
- |
- |
|||||||
|
E-AcOEt |
|
|
- |
- |
- |
|||||||
|
E-H2O |
|
|
- |
- |
- |
|||||||
|
|
|
|
|
|
|
|||||||
|
|
|
|
|
|
(à suivre) |
|||||||
|
|
|
|
|
|
|
|||||||
|
|
|
|
|
|
|
|||||||
Tableau 34. Résultats du criblage des fractions obtenues après purification d’extraits bruts de neuf plantes du Brésil en vue de la recherche d’inhibiteurs de la pompe NorA. (suite) |
|||||||||||||
|
|
|
|
|
|
||||||||
Espèce et extraits |
|
|
S. aureus ATCC |
S. aureus NorA |
S. aureus NorA + CIP |
||||||||
Annona crassifolia |
|
|
|
|
|
||||||||
Ecorce |
E-CHCl3/ |
C-Hex/CHCl3
(1/1) |
|
- |
- |
+ |
|||||||
|
|
C-CHCl3 |
|
- |
- |
++ |
|||||||
|
|
C-AcOEt |
|
- |
- |
++ |
|||||||
Graine |
Brut |
|
|
+ |
- |
++ |
|||||||
|
E-CHCl3 |
|
- |
- |
++ |
||||||||
|
E-AcOEt |
|
- |
- |
+ |
||||||||
|
E-H2O |
|
|
- |
- |
- |
|||||||
|
E-AcOEt / |
C-Hex/AcOEt 70% |
|
- |
nd |
+ |
|||||||
|
|
C-Hex/AcOEt 50% |
|
- |
nd |
- |
|||||||
|
|
C-Hex/AcOEt 25% |
|
- |
nd |
++ |
|||||||
|
|
C-MeOH |
|
- |
nd |
++ |
|||||||
|
|
C-AcOEt |
|
++ |
nd |
++ |
|||||||
|
|
|
|
|
|
||||||||
Annona muricata |
|
|
|
|
|
||||||||
Feuille |
Brut |
|
|
+ |
- |
+ |
|||||||
|
E-CHCl3 |
|
- |
- |
+ |
||||||||
|
E-AcOEt+EtOH |
|
- |
- |
- |
||||||||
|
E-H2O/EtOH (7/3) |
|
- |
- |
- |
||||||||
|
E-H2O/EtOH (1/1) |
|
- |
- |
++ |
||||||||
E-H2O/EtOH (1/1) |
C-EtOH |
|
- |
- |
+ |
||||||||
|
C-AcOEt/EtOH (1/1) |
|
- |
- |
+ |
||||||||
|
C-MeOH |
|
- |
- |
+ |
||||||||
E-H2O/EtOH (1/1) |
F3 F(16) |
|
- |
nd |
- |
||||||||
|
F4 F(16) |
|
- |
nd |
- |
||||||||
|
F5 F(16) |
|
- |
nd |
- |
||||||||
|
F1 F(17) |
|
- |
nd |
- |
||||||||
|
F2 F(17) |
|
- |
nd |
- |
||||||||
|
F(3-5) F(17) |
|
- |
nd |
++ |
||||||||
|
F6 F(17) |
|
- |
nd |
- |
||||||||
|
|
|
|
|
|
||||||||
Lafoensia
pacari |
|
|
|
|
|
||||||||
Ecorce |
Brut |
|
|
+ |
++ |
++ |
|||||||
|
E-Hex |
|
|
- |
- |
- |
|||||||
|
E-CHCl3 |
|
|
- |
- |
- |
|||||||
|
E-AcOEt |
|
|
+ |
++ |
++ |
|||||||
|
E-H2O |
|
|
+ |
++ |
++ |
|||||||
|
E-AcOEt / |
C-CHCl3 |
|
- |
- |
- |
|||||||
|
|
C-AcOEt |
|
- |
- |
- |
|||||||
|
|
C-AcOEt/MeOH 10 %* |
+ |
++ |
++ |
||||||||
|
|
|
|
|
|
||||||||
Serjania lethalis |
|
|
|
|
|
||||||||
Tige |
Brut |
|
|
+ |
+ |
++ |
|||||||
|
E-Hex |
|
|
- |
- |
- |
|||||||
|
E-CHCl3 |
|
|
- |
- |
++ |
|||||||
|
E-AcOEt |
|
|
++ |
++ |
++ |
|||||||
|
E-H2O |
|
|
++ |
++ |
++ |
|||||||
Feuilles |
Brut |
|
|
++b |
++ |
++ |
|||||||
|
E-Hex |
|
|
- |
- |
- |
|||||||
|
E-CHCl3 |
|
|
- |
- |
- |
|||||||
|
E-AcOEt |
|
|
++ |
+ |
++ |
|||||||
a CMI
= 100 µg/ml ; b CMI = 64 µg/ml ; * fraction
purifiée mais toutes les fractions résultantes sont dépourvues d’activité
(cf. Tableau 29) ; -, extrait inactif ; +, extrait peu
actif ; ++, extrait actif ; nd, non déterminé. |
|||||||||||||
Figure 60. Structure
du 4-phényl-2,6-diméthyle-3,5-pyridinedicarboxylate de diéthyle (composé B),
isolé du
rhizome de J. elliptica, qui présente une bonne activité d’inhibiteur de
la pompe d’efflux NorA.
Tableau 35. Effet de l’association de G03 avec
différentes molécules sur leurs CMI vis-à-vis de la souche résistante SA-1199B
et sur la souche parentale sensible SA-1199.
|
|
CMI (µg/ml) |
||
|
|
G03 |
CIP |
EtBr |
SA-1199B |
Pas d’association |
> 200 |
16 |
48 |
|
+ RES 20 µg/ml |
|
4 (4)* |
12 (4) |
|
+ G03 20 µg/ml |
|
4 (4) |
8 (6) |
|
|
|
|
|
SA-1199 |
Pas d’association |
|
0,37 |
8 |
|
+ RES 20 µg/ml |
|
0,37 |
nd |
|
+ G03 20 µg/ml |
|
0,25 |
4 (2) |
* Les valeurs indiquées entre parenthèses correspondent au facteur de diminution de la CMI ; nd, non déterminé.
Tableau
36. Effet de l’association du composé B avec
différentes molécules sur leurs CMI vis-à-vis de la souche résistante SA-1199B
et sur la souche parentale sensible SA-1199.
|
|
CMI (µg/ml) |
|||||
|
|
B |
CIP |
NOR |
PEF |
ACR |
EtBr |
SA-1199B |
Pas d’association |
> 500 |
16 |
64 |
8 |
48 |
48 |
|
+ RES 20 µg/ml |
|
4 (4)* |
24 (3) |
8 (1) |
24 (2) |
12 (4) |
|
+ B 100 µg/ml |
|
3 (5,5) |
12 (5,5) |
6 (1,5) |
4 (8,5) |
3 (17) |
|
+ B 75 µg/ml |
|
4 (4) |
16 (4) |
6 (1,5) |
6 (4) |
6 (8,5) |
|
+ B 50 µg/ml |
|
6 (3) |
32 (2) |
8 (1) |
12 (4) |
12 (4) |
|
+ B 25 µg/ml |
|
8 (2) |
48 (1,5) |
8 (1) |
48 (1) |
24 (2) |
|
|
|
|
|
|
|
|
SA-1199 |
Pas d’association |
|
0,37 |
1 |
|
|
|
|
+ RES 20 µg/ml |
|
0,37 |
0,75 |
|
|
|
|
+ B 100 µg/ml |
|
0,25 |
0,5 |
|
|
|
* Les valeurs indiquées entre parenthèses correspondent au facteur de diminution de la CMI.
Figure 61. Isobologrammes
obtenus pour l’association composé B - CIP (A) et composé B- EtBr (B) vis-à-vis
de la souche de S. aureus NorA.
Figure 62. Efflux
de
EtBr (10 µg/ml) par la souche résistante SA-1199B et par la
souche sensible SA-1199, exprimé en unités arbitraires de fluorescence en
fonction du temps, sans inhibiteur, et en présence des inhibiteurs de référence
RES et CCCP à 20 µg/ml.
Figure 63. Accumulation de EtBr (10 µg/ml) par la souche résistante SA-1199B et par la
souche sensible SA-1199, exprimé en unités arbitraires de fluorescence en
fonction du temps, sans inhibiteur, et en présence des inhibiteurs de référence
RES et CCCP à 20 µg/ml.
Les inhibiteurs sont ajoutés après 10 min, comme indiqué par la flèche.
Figure 64.
Accumulation de la ciprofloxacine (10 µg/ml) par la
souche résistante SA 1199B et par la souche sensible SA 1199. Les résultats sont exprimés en concentration intracellulaire de CIP
(µg/ml) en fonction du temps. La RES est ajoutée (20 µg/ml) après 10
minutes, comme indiqué par la flèche.
Figure 65. Accumulation de EtBr (10 µg/ml) par la
souche résistante de S. aureus NorA
(A), exprimé en unités arbitraires de fluorescence en fonction du temps, et
efflux de EtBr (10 µg/ml) par cette même souche (B).
Expériences sans inhibiteur, en présence des inhibiteurs de référence RES et CCCP à 20 µg/ml, et en présence de différentes concentrations de la molécule G03. La même légende est employée pour les deux graphiques. Pour l’expérience d’accumulation de EtBr (A), les inhibiteurs sont ajoutés après 10 min, comme indiqué par la flèche.
Figure 66. Efflux
de EtBr (10µg/ml) par la souche résistante de S. aureus NorA en
présence de deux analogues de G03, le benzothiophène F10 et le benzofurane E04.
Les résultats sont exprimés en unités arbitraires de fluorescence en fonction
du temps ; les deux molécules ainsi que la RES sont employées à la
concentration de 20 µg/ml.
Figure 67. Efflux de EtBr (10µg/ml) par la souche
résistante de S. aureus NorA en présence de deux indoles, les
molécules LEDSS 01-05-L-A02 et 01-05-L-E11. Les résultats sont exprimés en
unités arbitraires de fluorescence en fonction du temps ; les molécules
ainsi que la RES sont employées à la concentration de 20 µg/ml, sauf * à 10
µg/ml.
Figure 68. Structures des indoles utilisés pour
l’expérience d’efflux de EtBr par S. aureus NorA.
Figure 69. Efflux
de EtBr (10 µg/ml) par la souche résistante de S. aureus NorA (A), exprimé en unités arbitraires de
fluorescence en fonction du temps, et accumulation de EtBr (10 µg/ml) par cette
même souche (B), sans inhibiteur, en présence des inhibiteurs de référence RES
et CCCP à 20 µg/ml, et en présence de différentes concentrations du composé B.
La même légende est employée pour les deux graphiques ; pour l’expérience
d’accumulation de EtBr (B), les inhibiteurs sont ajoutés après 10 min, comme
indiqué par la flèche.
Figure 70. Accumulation
de CIP par la souche de S. aureus NorA,
sans inhibiteur, en présence des inhibiteurs de référence RES et CCCP à 20
µg/ml, et en présence de différentes concentrations du composé B. Les
inhibiteurs sont ajoutés après 6 min, comme indiqué par la flèche.
Tableau
37. Effet de l’association de G03 avec CIP et
EtBr sur leurs CMI vis-à-vis de la souche résistante de B. subtilis
ΔΔNA.
|
CMI (µg/ml) |
||
|
G03 |
CIP |
EtBr |
Pas d’association |
>
200 |
1 |
32 |
+ RES 20 µg/ml |
|
0,5
(2)* |
8 (4) |
+ G03 20 µg/ml |
|
0,25
(4) |
4 (6) |
* Les valeurs indiquées entre parenthèses correspondent au facteur de diminution de la CMI.
Figure 71. Isobologramme
obtenu pour l’association G03-CIP vis-à-vis de la souche de B.
subtilis DDNA.
Figure 72. Efflux
de EtBr (5 µg/ml) par la souche résistante de B. subtilis DDNA,
exprimé en unités arbitraires de fluorescence en fonction du temps, sans
inhibiteur, en présence des inhibiteurs de référence RES et CCCP à 20 µg/ml, et
en présence de la molécule G03 à 20 µg/ml.
Figure 73. CMI
de quatre associations molécule – érythromycine vis-à-vis de la souche de S. aureus Msr(A).
Les molécules F08, D04 et F02 montrent une synergie avec ERY alors que la molécule E08 présente un simple effet additif. Les molécules F02 et E08 sont sans effet sur la CMI de ERY lorsqu’elles sont employées à 25 µg/ml, les points correspondants ne sont pas indiqués pour plus de clarté sur le graphique.
Figure 74. Structures de deux touches issues du
criblage vis-à-vis de S. aureus Msr(A).
Figure 75.
Accumulation de [14C]-érythromycine (0,75 µg/ml) par la souche
résistante de S. aureus Msr(A) et la souche sensible de S.
aureus ATCC 25923, sans inhibiteur, et en présence de CCCP (100 µM) ou
d’arsenate de sodium (10 mM).
Tableau 38. Détermination de CMI de streptogramines vis-à-vis
de souches de S. epidermidis.
|
CMI (µg/ml) |
||
|
Pristinamycine |
Pristinamycine II A (facteur A) |
Pristinamycine I A (facteur B) |
S. epidermidis BM 3302 |
0,12 |
2 |
16 |
S. epidermidis VgaA IPF263 |
0,5 |
64 |
16 |
S. epidermidis VgaB IPF761 |
4 |
8 |
16 |
MEQYTIKFNQINHKLTDLRSLNIDHLYAYQFEKIALIGGNGTGKTTLLNMIAQKTKPESG
TVETNGEIQYFEQLNMDVENDFNTLDGSLMSELHIPMHTTDSMSGGEKAKYKLANVISNY
SPILLLDEPTNHLDKIGKDYLNNILKYYYGTLIIVSHDRALIDQIADTIWDIQEDGTIRV
FKGNYTQYQNQYEQEQLEQQRKYEQYISEKQRLSQASKAKRNQAQQMAQASSKQKNKSIA
PDRLSASKEKGTVEKAAQKQAKHIEKRMEHLEEVEKPQSYHEFNFPQNKIYDIHNNYPII
AQNLTLVKGSQKLLTQVRFQIPYGKNIALVGANGVGKTTLLEAIYHQIEGIDCSPKVQMA
YYRQLAYEDMRDVSLLQYLMDETDSSESFSRAILNNLGLNEALERSCNVLSGGERTKLSL
AVLFSTKANMLILDEPTNFLDIKTLEALEMFMNKYPGIILFTSHDTRFVKHVSDKKWELT
GQSIHDIT
Figure 76. Séquence d’acides aminés de la protéine Msr(A) [357].
Les
motifs Walker A et B du NBD N-terminal sont en caractères rouges gras, le motif
Signature en rose ; les mêmes séquences dans le domaine C-terminal sont en
bleu et turquoise. En orange est représentée la partie centrale construite, les
résidus soulignés sont ceux pour lesquels il existe un chevauchement (jonction
N-terminale) ou un décalage (jonction C-terminale) entre les NBD et la partie
centrale modélisée. Les résidus aromatiques en vert sont ceux utilisés dans
l’alignement avec le résidu aromatique situé avant le motif Walker A.
Tableau 39. Récapitulatif des modèles construits pour la
protéine Msr(A).
Orientation des NBD |
selon le mutant MJ0796 |
selon la protéine ArsA |
selon GRAMM |
Liens |
|
|
|
Modèle A |
modèle 7 |
modèle 1 |
modèle 4 |
Modèle B |
à faire |
modèle 2 |
modèle 5 |
Modèle C |
modèle 8 |
modèle 3 |
modèle 6 |
Figure 77. alignements réalisés pour la modélisation du domaine NBD C-terminal de la protéine Msr(A).
Séquence DIQEDGTIRVFKGNYTQYQNQYEQEQLEQQRKYEQYISEKQRLSQASKAKRNQAQQMAQASSKQKNKSIA
SSPro EEECCCEEEEECCCHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHCCCCCCCCCCCC
3D-PSSM CCCCCCEEEEEEEEEEECCCCCCHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHCCCCCCCH
NNPredict -------EEEE-------------HHHHHH--H-EHHHHHHHHHHH-HH-HHHHHHHHHH----------
PHD HH-----EEEE----HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH------------
APSSP EECCCCEEEEEECCCHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHCCCCCCC
PSA HHHLLLLSSSSLLLLLLHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHLLLLLL
Séquence PDRLSASKEKGTVEKAAQKQAKHIEKRMEHLEEVEKPQSYHEFNFPQNKIYDIHNNYP
SSPro CCCCCHCHHCCCHHHHHHHHHHHHHHHHHHHCCCCCCCCCCCCCCCHHHHHHHHCCCE
3D-PSSM HHHHHCCCCCCHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHCCCCCCCCCCCEECCCCCHHHHHCCCC
NNPredict -----------HHHHHHHHHHHHHHHHHHHH--H----------------E-------
PHD --------------HHHHHHHHHHHHHHHHHHH-------------------------
APSSP CCHHCHHCCCCHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHCCCCCCCCCCCCCCCCEEECCCCCC
PSA LLLHHHHLLLLLHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLLL
Figure 78. Comparaison des résultats de prédiction de la structure secondaire pour la partie centrale de Msr(A) (résidus D171 à P298).
La séquence d’aa de la protéine Msr(A) est en haut (code à une lettre), les résultats de prédiction de structure secondaire obtenus avec 6 programmes en dessous, H, hélice ; E, feuillet ; C, « coil » ; -, pas de prédiction.
Figure 79. Modèles établis pour la partie centrale de la protéine Msr(A).
Figure 80. Modèles 7, à gauche, et 8, à droite, établis
pour la protéine Msr(A).
Les molécules d’ATP ne sont pas représentées, les hélices a sont en rose et les feuillets b en orange.
Figure 81. Inhibiteurs de la pompe NorA contenant un motif indole.
L’inhibiteur de référence, la réserpine, un nitroindole identifié par Markham et al. [240] et quatre molécules identifiées lors de notre criblage dont la concentration efficace indique la concentration de molécule qui permet de restaurer la CMI de CIP à 4 µg/ml vis-à-vis de S. aureus NorA.
Tableau 40. CMI de différents antibiotiques sur la
souche résistante de L. lactis MG1363 LmrP et sur la souche sensible de L.
lactis MG1363.
|
CMI (µg/ml) |
|||
|
ERY |
Lincomycine |
Pristinamycine |
Tétracycline |
L. lactis LmrP |
> 512 |
64-128 |
1 |
1 |
L.
lactis |
< 1 |
2-4 |
1-0,5 |
1 |
Figure 82. Efflux de EtBr par la souche résistante de L.
lactis LmrP, exprimé en unités arbitraires de fluorescence en fonction du
temps, sans inhibiteur et en présence de CCCP (20 µg/ml).
Figure 83. Fenêtre de travail du menu Edit du robot Biomek 2000.
Figure 84. Représentation
de la surface de travail du robot Biomek 2000.