Contributions to the study of yeast detoxification by ABC-transporters: 1 - biochemical study of Yor1p; 2 - role of thiols in the toxicity of selenium. - Archive ouverte HAL Access content directly
Theses Year : 2005

Contributions to the study of yeast detoxification by ABC-transporters: 1 - biochemical study of Yor1p; 2 - role of thiols in the toxicity of selenium.

Contributions à l'étude de la détoxication de la levure par les transporteurs ABC: 1 - étude biochimique de Yor1p; 2 - rôle des thiols dans la toxicité du sélénium.

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Abstract

The ABC-proteins form a large family of proteins present in all the living organisms. These proteins use the energy of ATP hydrolysis to transport a wide range of substances across biological membranes. In humans, some of these proteins have significant implications in pathology. For example, dysfunction of CFTR causes cystic fibrosis, and the overproduction of MRP1 is often associated with multidrug resistance phenomena. The yeast Saccharomyces cerevisiae has a cluster of 6 proteins (Y! or1p, Ycf1p, Bpt1p, Ybt1p, Vmr1p, Nft1p) homologous to CFTR and MRP1. This family can thus serve as a model for the study of human proteins. The first part of this work was a biochemical study of the yeast protein Yor1p. We added a histidine tag to the YOR1 gene and placed this construction under the control of a promoter allowing an overproduction in yeast. We showed that the histidine tagged Yor1p was produced in a functional form and, subsequently, we developed a method allowing the solubilization and the purification of Yor1p in a single step by metal affinity chromatography. In a second part of this work, we produced in an isolated form in Escherichia coli the two NBD domains of Yor1p that are involved in ATP binding and hydrolysis and purified them to homogeneity. We studied ATP binding to these two domains, and were able to conclude that these domains are well structured. Thus, they can now be used for structural studies. Finally, we considered the role of Ycf1p in selenite detoxification. We observed that the selenite toxicity for yeast was considerably increased in the presence of thiols. The formation of reactive oxygen species is probably at the origin of this hypertoxicity.
Les transporteurs ABC forment une vaste famille de protéines présentes dans tous les organismes vivants. Ces protéines utilisent l'énergie fournie par l'hydrolyse de l'ATP pour transporter à travers les membranes biologiques des substances très variées. Plusieurs protéines ABC sont importantes pour la santé humaine. Par exemple, le défaut fonctionnel de la protéine CFTR cause la mucoviscidose et la surproduction de protéine MRP1 est associée aux phénomènes de résistance aux traitements anti-tumoraux. La levure Saccharomyces cerevisiae possède une famille de protéines (Yor1p, Ycf1p, Bpt1p, Ybt1p, Vmr1p, Nft1p) apparentées à CFTR et MRP1. Cette famille peut servir de modèle à l'étude des protéines humaines. La première partie de ce travail de thèse a été consacrée à l'étude biochimique de la protéine de levure Yor1p. Nous avons fusionné YOR1 avec un fragment d'ADN codant un peptide de poly-histidine et avons placé cette construction sous contrôle d'un promoteur permettant une surproduction dans la levure. Nous avons alors montré que la protéine Yor1p poly-histidylée était produite sous forme fonctionnelle dans la levure, puis avons mis au point une méthode permettant de solubiliser puis de purifier cette protéine en une seule étape par chromatographie d'affinité sur une colonne greffée avec des ions métalliques. La deuxième partie de ce travail a consisté à produire sous forme isolée chez la bactérie Escherichia coli et à purifier à homogénéité les deux domaines de Yor1p impliqués dans la liaison et l'hydrolyse de l'ATP. Nous avons étudié la fixation de l'ATP sur ces deux domaines, ce qui nous a permis de conclure que ces domaines étaient bien structurés. Ils peuvent maintenant être utilisés pour des études structurales. Enfin, nous nous sommes intéressés au rôle la protéine Ycf1p dans la détoxication du sélénite. Nous avons observé que la toxicité du sélénite pour la levure était considérablement accrue par la présence de composés thiolés dans le milieu de culture. La formation de dérivés réactifs de l'oxygène est vraisemblablement à l'origine de cette hypertoxicité.
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Dates and versions

pastel-00001994 , version 1 (28-07-2010)

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  • HAL Id : pastel-00001994 , version 1

Cite

Ioana Grigoras. Contributions à l'étude de la détoxication de la levure par les transporteurs ABC: 1 - étude biochimique de Yor1p; 2 - rôle des thiols dans la toxicité du sélénium.. Biochimie, Biologie Moléculaire. Ecole Polytechnique X, 2005. Français. ⟨NNT : ⟩. ⟨pastel-00001994⟩
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