Génération de seconde harmonique par le collagène et application à l'étude de fibroses par microscopie multiphoton. - Archive ouverte HAL Access content directly
Theses Year : 2006

Génération de seconde harmonique par le collagène et application à l'étude de fibroses par microscopie multiphoton.

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Abstract

Multiphoton microscopy is an optical imaging technique which has the unique ability of providing three-dimensional micrometer resolution within thick tissues. Another attractive feature is that it is possible to visualise the structure of an unstained cell or tissue using endogenous sources of contrast that allow for a less invasive imaging method. Moreover, different contrast modes like two-photon excited fluorescence (2PEF), second harmonic generation (SHG) or third harmonic generation (THG) can be easily combined, and all these features enable a wide range of applications of multiphoton microscopy in fields like neurosciences, oncology, embryology,... Meanwhile, progresses are still needed in order to completely characterize the endogenous sources of nonlinear optical contrast observed in biological media. Thus, the second harmonic generation from fibrillar collagen raised different questions in the beginning of this work, mainly on the role of the collagen type and the role of its triple helical structure (that means the chirality) in the SHG signal. The study of collagen is particularly interesting for this protein represents 30% of the total human body proteins. The collagen is the main constituent of the extracellular matrix of a wide variety of tissues and organs and hence it is involved in the remodelling of the extracellular matrix and numerous pathologies. But nowadays there's a lack of appropriate methodologies to visualise the 3D architecture of collagen at a micrometer scale. In this context, the SHG microscopy appears as a promising tool for the visualisation of the distribution of collagen within the tissues. This work started with polarisation-resolved surface second harmonic generation experiments on thin films of collagen I and IV molecules, which allowed us to demonstrate that the SHG microscopy is a sensitive probe of collagen macromolecular organization and not of the collagen type. We next applied these results to the study of pulmonary and renal fibrosis in animal models, a pathological accumulation of fibrillar collagen which can progress to a terminal renal insufficiency or to a respiratory insufficiency often lethal eventually. We demonstrated that multiphoton microscopy permit to visualise the morphology of these tissues, to evidence all the characteristic features of these pathologies and quantitatively evaluate the remodelling of the extracellular matrix during fibrosis. Finally, we have proposed fibrosis scores based on volume fractions of significant SHG signals which allowed us to appreciate the role of different factors (cells/assembling enzymes) in fibrosis. This methodology will help to develop new therapeutic approaches based on a better understanding of these fibrotic pathologies.
La microscopie multiphoton est une technique d'imagerie optique dont une des caractéristiques les plus remarquables est de fournir une information micrométrique en profondeur dans les tissus intacts. Un autre intérêt est la possibilité de visualiser la structure d'une cellule ou d'un tissu en utilisant des sources de contraste endogènes qui permettent une imagerie très peu invasive. De plus, divers modes de contrastes tels que la fluorescence excitée à deux photons (2PEF), la génération de seconde harmonique (SHG) ou la génération de troisième harmonique (THG) sont facilement combinables, et les applications de la microscopie multiphoton sont ainsi nombreuses et variées, dans des domaines comme les neurosciences, la cancérologie, l'embryologie,... Cependant, des progrès sont encore nécessaires dans la compréhension des contrastes optiques non-linéaires endogènes observés dans les tissus. Dans ce contexte, la génération de seconde harmonique par le collagène fibrillaire soulevait différentes questions au début de ce travail, notamment sur la spécificité de la SHG en fonction du type de collagène et sur le rôle de sa structure chirale en triple hélice dans la forte amplitude des signaux observés. L'étude du collagène est particulièrement intéressante car il représente 30 % du contenu total du corps humain en protéines. Constituant principal de la matrice extracellulaire d'une grande variété de tissus et d'organes, le collagène est impliqué dans tout remodelage de la matrice extracellulaire et dans de nombreuses pathologies, mais on manque actuellement d'outils performants pour visualiser son architecture tridimensionnelle à l'échelle micrométrique. Dans ce contexte, la microscopie SHG est un outil prometteur pour visualiser la distribution du collagène dans les tissus. Ce travail de thèse a débuté avec des expériences de génération de seconde harmonique en surface résolue en polarisation sur des films minces de molécules de collagène de type I et IV, qui nous ont permis de démontrer que la microscopie SHG est une sonde de l'organisation macromoléculaire du collagène et non pas du type de collagène. Nous avons appliqué ensuite ces résultats à l'étude de la fibrose collagénique pulmonaire et rénale dans des modèles murins, une accumulation pathologique de collagène fibrillaire qui peut conduire à une insuffisance rénale terminale ou à une insuffisance respiratoire souvent létale à terme. Nous avons démontré que la microscopie multiphoton permet de visualiser la morphologie de ces tissus, de mettre en évidence toutes les caractéristiques de ces pathologies et d'évaluer quantitativement le remodelage de la matrice extracellulaire au cours de l'évolution de la fibrose. Finalement, nous avons proposé des scores de fibrose basés sur des densités volumiques de pixels SHG qui nous ont permis d'apprécier le rôle de certains facteurs (cellules/enzymes d'assemblage) responsables de la fibrose. Ce travail devrait ainsi permettre de proposer de nouvelles approches thérapeutiques pour ces pathologies fibrosantes.
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Dates and versions

pastel-00002033 , version 1 (28-07-2010)

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  • HAL Id : pastel-00002033 , version 1

Cite

Ana-Maria Pena. Génération de seconde harmonique par le collagène et application à l'étude de fibroses par microscopie multiphoton.. Biophysique [physics.bio-ph]. Ecole Polytechnique X, 2006. Français. ⟨NNT : ⟩. ⟨pastel-00002033⟩
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