Ligand transfer in cytochrome c oxidase observed with spectrally integrated and spectrally resolved infrared femtosecond experiments.
Transfert de ligand dans la cytochrome c oxydase observé par des expériences femtosecondes infrarouge intégrées et résolues spectralement.
Résumé
Dynamic experiments on hemoproteins, in particuliar spectroscopy experiments, are essential to understand how these proteins accomplish their function. In this context, we have employed infrared femtosecond spectroscopy in order to study the transfer of carbon monoxide in cytochrome c oxidase, from the iron to the copper atom of its bimetallic active site. Infrared experiments are sensitive to the CO vibrational frequency changes and enable us to follow directly the dynamics of the CO transfer. This transfer from the iron to the copper atom takes place on a subpicosecond scale, this is why femtosecond resolution is needed. We developped two infrared femtosecond experiments : a spectrally integrated experiment and a spectrally resolved experiment. In the spectrally integrated experiment, we identified a signal due to the heme absorption. This signal was subtracted from the cinetics in order to extract the signal induced by the CO transfer. A caracteristic time of 400 fs was determined for this transfer. In the spectrally resolved experiment, we observed the evolution of the absorption bands of CO. This evolution shows a delay of 200 fs suggesting a ballistic contribution in the CO transfer. The spectrally resolved experiment uses a new technique recently developped in the laboratory for the characterization of the infrared pulse through upconversion. The signal-to-noise ratio and the resolution accessible with this technique enable the acquisition of an ensemble of differential spectra that is sufficient to validate a new filtering procedure for systematic removal of oscillations due to the pump-perturbed polarization artifacts. Molecular dynamic simulations were performed to model the transfer of CO in cytochrome c oxidase, from the iron to the copper atom of its bimetallic site. These simulations are in good agreement with the experimental results and show that the path from the iron to the copper atom is reproducible. This corroborates the presence of a ballistic component in the transfer.
L'étude dynamique des hémoprotéines, indispensable à la compréhension du fonctionnement de leur site actif, a considérablement progressé grâce aux expériences de spectroscopie. Nous avons étudié dans ce cadre le transfert du ligand CO au sein du site actif bimétallique de la cytochrome c oxydase, du Fer de l'hème à l'atome de Cuivre, par spectroscopie femtoseconde infrarouge. Les expériences dans l'infrarouge permettent d'analyser les caractéristiques vibrationnelles des molécules et de suivre ainsi directement le transfert du ligand par l'intermédiaire de sa signature vibrationnelle. Afin de résoudre le transfert étudié, qui se produit sur une échelle subpicoseconde, l'expérience doit avoir une résolution femtoseconde. Deux expériences pompe-sonde femtoseconde dans le domaine infrarouge, une expérience intégrée spectralement et une expérience résolue spectralement, ont été mises en place. Ces deux expériences ont apporté des informations complémentaires sur le transfert du ligand CO au sein du site actif de la cytochrome c oxydase. Dans le cas de l'expérience intégrée spectralement, un signal supplémentaire dû à l'absorption des molécules d'hème a été identifié et soustrait aux cinétiques afin d'isoler le signal induit par le transfert du CO. Le temps caractéristique de ce transfert a ainsi pu être évalué à 400 fs. Lors de l'expérience résolue spectralement, l'évolution des raies d'absorption du CO présente un décalage de 200 fs qui suggère une composante balistique dans le transfert. L'expérience résolue spectralement a été réalisée à l'aide d'une nouvelle technique de mesure du spectre infrarouge par conversion vers le visible, développée au laboratoire. Cette technique, qui offre un meilleur rapport signal sur bruit et une meilleure résolution que les approches concurrentes, a permis d'acquérir un ensemble de spectres différentiels suffisant pour valider expérimentalement une nouvelle technique de filtrage des oscillations de cohérence. Nous avons réalisé des simulations de dynamique moléculaire qui modélisent le transfert du ligand CO dans la cytochrome c oxydase, du Fer de l'hème vers l'atome de Cuivre. Ces simulations sont en bon accord avec les résultats expérimentaux et ont montré que le trajet emprunté par le CO lors de son transfert est reproductible, ce qui corrobore un transfert balistique.
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