Evolution dirigée de deux aminoacyl-ARNt synthétases : Mise en place et applications d'une méthode de 'protein design'.
Résumé
Protein design aims to develop new proteins with new structural and/or functional properties. The principle is to identify among the available sequences, those that preserve the protein's three dimensional fold and that confer the desired properties. The general procedure can be decomposed into two steps : (i) the interaction energy between all the residue pairs is precomputed and stored in an energy matrix taking into account all amino acid types and all possible conformations, (ii) an optimization algorithm explores simultaneously sequence and conformational space to determine the best amino acid combination. Next, different filters (based on affinity, protein stability...) can be applied to separate functional sequences (for a given fold) from the non functional ones. We first focused on the development of the protein design procedure, particularly, on the setting up and optimization of the energy function and the implementation of the optimization algorithm. We have shown that our procedure is robust because it performs well for a wide variety of applications crucial in protein design such as: prediction of sidechain orientation, prediction of stability or affinity changes due to point mutations and design of native-like sequences for a set of globular proteins. For all of these applications the quality of results is competitive with those obtained by other groups. Next, we applied our procedure to more complex systems such as protein:ligand complexes. We focused on aspartyl-tRNA synthetase (AspRS) and asparaginyl-tRNA synthetase (AsnRS). These enzymes play a crucial role in preserving the accuracy of genetic code translation, linking their specific amino acid to a cognate tRNA, which carries the corresponding anticodon. First, we performed the design of the whole active site of AspRS and AsnRS in presence of their specific or non specific ligands in order to test the performance of our procedure. The quality of the designed sequences is consistent with those observed on entire globular proteins. On the other hand, we showed that our procedure was sensitive to the nature of the ligand present in the active site. Finally, we performed the design of a limited number of selected positions of the AsnRS active site so that the synthetase can bind preferentially aspartate over asparagine. A set of promising mutants has been retained. Their stability and affinity for native and non-native ligands are now analyzed by molecular dynamics.
La conception des protéines ou ‘protein design' a pour but de développer des protéines possédant de nouvelles caractéristiques structurales et/ou fonctionnelles. Le principe consiste à identifier parmi toutes les séquences compatibles avec le repliement d'intérêt, celles qui vont conférer à la protéine, la fonction désirée. La procédure générale est réalisée en deux étapes. La première consiste à calculer une matrice d'énergie contenant les énergies d'interactions entre toutes les paires de résidus de la protéine en autorisant successivement tous les types d'acides aminés dans toutes leurs conformations possibles. La seconde étape, ou ‘phase d'optimisation', consiste à explorer simultanément l'espace des séquences et des conformations afin de déterminer la combinaison optimale d'acides aminés étant donné le repliement de départ. Ensuite, différents filtres peuvent être appliqués pour sélectionner les séquences fonctionnelles (étant donné le repliement d'intérêt) des non fonctionnelles. La première étape a consisté au développement de la procédure de ‘protein design', en particulier, à la mise en place et à l'optimisation de la fonction d'énergie ainsi qu'à l'implémentation de l'algorithme d'optimisation. Nous avons montré que notre procédure est robuste puisqu'elle a fait ses preuves dans des applications très diverses telles que la prédiction de l'orientation des chaînes latérales, la prédiction des changements de stabilité ou d'affinité associés à des mutations ponctuelles, ou encore la production de séquences de type natif pour un jeu de protéines globulaires. Pour l'ensemble de ces applications, la qualité des résultats obtenus est comparable à celle observée chez d'autres groupes. Ensuite, nous avons appliqué notre procédure à des systèmes plus complexes tels que les systèmes protéine:ligand. Nous nous sommes intéressés à l'aspartyl-ARNt synthétase (AspRS) et l'asparaginyl-ARNt synthétase (AsnRS). Ces enzymes jouent un rôle crucial dans la traduction du code génétique. Les synthétases fixent leur acide aminé spécifique sur leur ARNt correspondant établissant ainsi l'intégrité du code génétique. Tout d'abord nous avons réalisé le ‘design' des sites actifs d'AspRS et d'AsnRS en présence de leur ligand natif et non natif afin d'évaluer les performances de notre procédure. La qualité des séquences prédites est comparable à celle observée pour les protéines globulaires entières. Par ailleurs, nous avons montré que notre procédure était sensible à la nature du ligand présent dans la poche. Enfin, nous avons réalisé le ‘design' d'un nombre limité de positions dans le site actif de l'AsnRS de façon à ce qu'elle lie préférentiellement l'aspartate au détriment de l'asparagine. Un jeu de mutants prometteurs fut retenu. Leur stabilité et affinité pour les ligands natifs et non natifs est actuellement analysé par des simulations de dynamique moléculaire.