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Theses Year : 2008

Proteines : structure, function and evolution.

Protéines : Structure fonction et évolution.

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Abstract

Tetracyclines (Tc) are a family of important antibiotics, which bind specifically to the ribosome and several proteins. The most important mechanism of resistance to tetracycline is regulated by its binding as a Tc:Mg2+ complex to the Tet Repressor protein (TetR). It is thus of interest to increase our understanding of both Tc:TetR and Tc:ribosome binding. Crystal structures of several tetracyclines in complexes with proteins and ribosome have provided essential information. A complementary approach is to develop computer simulation models, which can be used to investigate the structure, dynamics, and thermodynamics of Tc:protein or Tc:ribosome complexes. Despite its importance, tetracycline has rarely been subjected to computer modeling, partly because of the need to first develop a molecular mechanics model for Tc. Here, we developed such a model, so as to be compatible with the CHARMM27 force field for proteins and nucleic acids, for 12 important tetracycline analogs, including plain tetracycline. Intermolecular force field parameters were derived from a standard supermolecule approach. The model reproduces the ab initio geometry and flexibility of each Tc. As tests, we did simulations of a Tc crystal, of Tc:Mg2+ and Tc:Ca2+ complexes in aqueous solution, and of a solvated complex between Tc:Mg2+ and the TetR. The model compares well with a wide body of experimental data. We first used our model to study Tc:TetR recognition which is a complex problem. We used free energy simulations to investigate the electrostatic interactions between protein and ligand and the possible role of induced fit in Tc binding. We found that tetracycline prefers an extended, zwitterionic state both in solution and in complex with the protein. Tc is thus preorganized for binding. In the absence of Tc, TetR is tightly bound to its operator DNA; upon binding of Tc it dissociates from the DNA, allowing expression of the repressed genes. Its tight control by Tc makes TetR broadly useful in genetic engineering. The Tc binding site is over 20 ˚ A from the DNA, so the binding signal must propagate a long distance. We use molecular dynamics simulations and continuum electrostatic calculations to elucidate the allosteric mechanism. When [Tc:Mg] + binds, the Mg2+ ion makes interactions with helix 8 of one TetR monomer and helix 6 of the other monomer, and helix 6 is pulled in towards the central core of the structure. Hy- drophobic interactions with helix 6 then pull helix 4 in a pendulum motion, with a maximal displacement at its N-terminus: the DNA interface. The N-terminal residue of helix 4, Lys48, is highly conserved in DNA-binding regulatory proteins of the TetR class and makes the largest contribution of any amino acid to the TetR:DNA binding free energy. Thus, the conformational changes lead to a drastic reduction in the TetR:DNA binding affinity, allowing TetR to detach itself from the DNA. We next used the model to study Tc binding to the ribosome and to elongation factor Tu (Ef-Tu). Crystal structures of Tc bound to the Thermus thermophilus 30S subunit show the same primary Tc binding site (called TET1), with the strongest Tc electron density, close to the A-site, consistent with an inhibitory role. A secondary Tc-binding site, called TET5 was also observed in two structures. We have done molecular dynamics (MD) simulations of 30S ribosomal subunits to characterize Tc binding and help resolve the ambiguity regarding the number and strength of Tc binding sites. We have presented evidence for predominant binding to TET1, showing that other reported binding sites are weaker and not highly occupied at physiological Tc concentrations. Recently, the crystal structure of a complex between elongation factor Tu (Ef-Tu) and Tc was solved, raising the question whether Tc's binding to Ef-Tu has a role in its inhibition of protein synthesis. We show that the direct contribution of Ef-Tu to the free energy of Tc binding to the Ef-Tu:GDP:Mg complex is negligible; rather, the binding can be solely attributed to Tc interactions with the Mg ion and the GDP phosphate groups. We also show that Ef-Tu does not exhibit any binding preference for Tc over the non-antibiotic, 4-dedimethyl-Tc, and Ef-Tu does not bind the Tc analogue tigecycline, which is a potent antibiotic. Overall, our results support the idea that Ef-Tu is not the primary target of tetracycline. The articles presented below include both computational and experimental results. All the experimental work was done by Winfried Hinrichs and his collabora-tors. All the computational work was done by myself. The insights obtained in this work and the modeling techniques employed should be of interest for engineering improved Tc antibiotics and improved TetR proteins for gene regulation.
Tétracyclines (TC) sont une famille d'antibiotiques important, qui se lient SPECI ャ ... allié aux protéines du ribosome et solidaire. Le mécanisme le plus important de la résistance à la tétracycline est régie par sa reliure en Tc: Mg2 + complexe à la protéine Tet Repressor (TetR). Il est donc d'intérêt pour améliorer notre compréhension des deux Tc: TetR et Tc: liaison au ribosome. Les structures cristallines des tétracyclines dans plusieurs complexes avec les protéines et les ribosomes ont fourni des informations essentielles. Une approche complémentaire consiste à développer des modèles de simulation par ordinateur, qui peut être utilisée pour étudier la structure, la dynamique et la thermodynamique de Tc: protéines ou Tc: complexes ribosome. Malgré son importance, à la tétracycline a rarement été soumis à la modélisation informatique, en partie en raison de la nécessité de ャ> St développer un modèle de mécanique moléculaire pour le TC. Ici, nous avons développé un tel modèle, de manière à être compatible avec le ャ CHARMM27 force »ld pour les protéines et les acides nucléiques, de 12 analogues de tétracycline importants, notamment la tétracycline plaine. paramètres ld ャ forces intermoléculaires ont été dérivées de supermolécule une approche standard. Le modèle reproduit la géométrie ab initio et Fxibility ャ de chaque Tc. Comme les tests, nous avons fait des simulations d'un cristal de Tc, Tc: Mg2 + et Tc: complexes Ca2 + en solution aqueuse, et d'un complexe solvaté entre TC: Mg2 + et le TetR. Le modèle se compare bien avec un large corpus de données expérimentales. Nous ャ> St utilisé notre modèle pour l'étude Tc: reconnaissance TetR qui est un problème complexe. Nous avons utilisé des simulations d'énergie libre pour étudier les interactions électrostatiques entre la protéine et ligand et le rôle éventuel de ャ induite "en Tc contraignant. Nous avons constaté que la tétracycline préfère une étendue, l'état zwitterioniques fois en solution et en complexe avec la protéine. Tc est donc préorganisés pour la reliure. En l'absence de Tc, TetR est étroitement liée à son ADN opérateur; lors de la liaison de Tc il se dissocie de l'ADN, permettant l'expression des gènes réprimés. Son contrôle serré par Transports Canada fait TetR largement utilisables dans le génie génétique. Le Tc site de liaison est plus de 20 ヒ A partir de l'ADN, de sorte que le signal de liaison doivent se propager sur une longue distance. Nous utilisons des simulations de dynamique moléculaire et calculs continuum électrostatique pour élucider le mécanisme allostérique. Lorsque [TC: Mg] lie +, l'ion Mg2 + permet des interactions avec hélice 8 de TetR un monomère et Helix 6 de l'autre monomère, et Helix 6 est tiré en direction du noyau central de la structure. Hy- interactions drophobic avec hélice 6 puis tirez hélice 4 dans un mouvement pendulaire, avec un déplacement maximum à son extrémité N-terminale: l'interface de l'ADN. Le résidu N-terminal de l'hélice 4, Lys48, est très conservée dans l'ADN de liaison des protéines régulatrices de la classe TetR et fait la plus grande contribution de tout acide aminé à l'TetR: l'ADN d'énergie libre contraignant. Ainsi, les changements de conformation conduire à une réduction drastique de la TetR: la liaison d'un ADN lité ャハ, permettant TetR se détacher de l'ADN. Nous avons ensuite utilisé le modèle pour l'étude Tc liaison au ribosome et de facteur d'élongation Tu (EF-Tu). Les structures cristallines de Tc lié à la Thermus thermophilus 30S sous-unité montrer le même site Tc primaire obligatoire (appelé TET1), avec la plus forte densité d'électrons Tc, à proximité du site A-, compatible avec un rôle inhibiteur. Un site secondaire Tc-contraignant, TET5 appelé a également été observée dans les deux structures. Nous avons fait de la dynamique moléculaire (MD) des simulations de sous-unités 30S du ribosome pour caractériser Tc contraignant et aider à résoudre l'ambiguïté en ce qui concerne le nombre et la force de Tc sites de liaison. Nous avons présenté des preuves pour les lier à TET1 prédominante, indiquant que d'autres sites de liaison signalés sont plus faibles et pas très occupés à des concentrations physiologiques Tc. Récemment, la structure cristalline d'un complexe entre le facteur d'allongement Tu (EF-Tu) et Tc a été résolu, ce qui soulève la question de savoir si Tc 窭 冱 contraignant à EF-Tu a un rôle dans l'inhibition de la synthèse protéique. Nous montrons que la contribution directe de EF-Tu à l'énergie libre de Tc contraignant à l'EF-Tu: PIB: complexe Mg est négligeable, mais plutôt la liaison peut être attribuée uniquement à Tc interactions avec l'ion Mg et le phosphate PIB groupes . Nous montrons aussi que EF-Tu ne présente pas de préférence contraignant pour le TC sur la non-antibiotiques, 4-dedimethyl-Tc, et EF-Tu ne lie pas la tigécycline analogique Tc, qui est un antibiotique puissant. Globalement, nos résultats appuient l'idée que les EF-Tu n'est pas la cible principale de la tétracycline. Les articles présentés ci-dessous comprennent à la fois de calcul et les résultats expérimentaux. Tout le travail expérimental a été réalisé par Winfried Hinrichs et ses collabora-teurs. Tout le travail de calcul a été fait par moi-même. Les connaissances acquises dans ce travail et les techniques de modélisation employées doivent être d'intérêt pour l'amélioration des techniques antibiotiques Tc et TetR protéines améliorées pour la régulation des gènes.
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pastel-00004205 , version 1 (22-07-2010)

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Alexey Aleksandrov. Protéines : Structure fonction et évolution.. Biologie moléculaire. Ecole Polytechnique X, 2008. Français. ⟨NNT : ⟩. ⟨pastel-00004205⟩
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