Influence of harvesting and concentration conditions on the physiological state and cryotolerance of lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus cfl1
Influence des conditions de recolte et de concentration sur l'etat physiologique et la cryotolerance de lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus cfl1
Résumé
This study aimed at quantifying the effect of harvesting and concentration steps on Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus CFL1 cryotolerance. It intended to analyse the physiological mechanisms that explained the different levels of cryotolerance. Another goal of this work consisted to submit the cells to a moderate stress, thus allowing them to adapt themselves to better resist the stress during the freezing step. During the first part of this work, the effect of an acidification, at the end of the fermentation, was studied on cellular cryotolerance. An experimental design made it possible to identify the optimal acidification condition (pH 5.25 for 30 min) that permitted adaptation of the cells. This condition provided highly resistant cells to freezing and frozen storage at -20 °C. Two physiological mechanisms were found to explain this adaptation. The first one corresponded to the increase of the membrane fatty acid C18:1 content, and then to membrane fluidity. From proteome analysis, the second one was characterized by a reduction in protein metabolism, an increase in energetic and nucleotide metabolism and a higher synthesis of stress proteins. In the second part of this study, cells were concentrated according to different centrifugation conditions (speed, duration and temperature). These conditions did not affect the resistance of Lb. bulgaricus CFL1 to the concentration process itself. However, they had a small but significant effect on their cryotolerance. As the behaviour of cells resistance during freezing and frozen storage was opposite, the effect of centrifugation conditions on their activity after long time storage was not significant. The last part of this work made it possible to analyse the effects of microfiltration conditions on Lb. bulgaricus CFL1 resistance to concentration, freezing and frozen storage and on its physiological responses. Results show that cells were less resistant to microfiltration than centrifugation. In contrast, their resistance to freezing was significantly improved (in a range of 28% to 88%), according to the microfiltration conditions applied, as compared to the centrifuged cells. The higher cryotolerance was obtained with a cross flow velocity of 2.01 m.s-1 and a transmembrane pressure of 0.15 MPa. This improved resistance was related to an increase of C16:0, C18:1 and cycC19:0 membrane fatty acid concentrations and a reduction of the C14:0 content. Results obtained from proteome analysis displayed that cells exhibiting high activity and resistance were characterized by an increase in their energetic metabolism and, in contrast, by a reduction in their general and protein metabolisms. Finally, during this thesis, two interesting approaches were performed with the aim to adapt Lb. bulgaricus CFL1 for a better cryotolerance. Some general physiological responses, responsible for the cellular adaptation, were identified at membrane and cytosolic levels.
Ce travail de thèse vise l'étude des effets des étapes de récolte et de concentration des cellules, sur la dégradation des fonctionnalités de Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus CFL1. Cet objectif s'accompagne de l'identification des mécanismes physiologiques qui expliquent les différences observées. La mise en œuvre de conditions de stress modéré, permettant aux cellules de s'adapter au stress ultérieur de congélation, constitue le troisième volet abordé dans cette thèse. Lors de la première partie du travail, l'effet d'une acidification en fin de fermentation sur la cryotolérance des cellules a été analysé. Un plan d'expériences a permis de définir la condition optimale d'acidification (pH 5,25 pendant 30 min) induisant une adaptation des cellules. Elle conduit à une meilleure résistance à la congélation et au stockage à -20 °C. Deux mécanismes physiologiques à l'origine de cette adaptation ont été identifiés. Le premier est lié à l'augmentation de la concentration de l'acide gras membranaire C18:1. Le deuxième, caractérisé pour l'analyse du protéome cytoplasmique, correspond à une réduction du métabolisme azoté, une augmentation des métabolismes énergétique et nucléotidique, et à une synthèse plus importante de protéines de stress. Dans une deuxième étape, les cellules ont été concentrées selon différentes conditions de centrifugation (vitesse de rotation, durée et température). Celles-ci n'ont pas d'effet sur la résistance de Lb. bulgaricus CFL1 à l'étape de concentration elle-même, mais présentent un effet faible mais significatif sur leur cryotolérance. Les évolutions de la résistance des cellules à la congélation et au stockage étant opposés, l'effet des conditions de centrifugation sur les cellules stockées à long terme est cependant négligeable. La troisième partie de ce travail a permis de quantifier l'impact de la concentration des cellules par microfiltration, sur leur résistance aux différentes étapes du procédé et sur l'état physiologique de Lb. bulgaricus CFL1. Les résultats montrent que les cellules sont moins résistantes à l'étape de microfiltration qu'à la centrifugation. Par contre, la résistance à la congélation augmente significativement (entre 28 % et 88 %) selon les conditions de microfiltration appliquées, par rapport à la centrifugation. La meilleure cryotolérance a été obtenue pour une vitesse tangentielle égale à 2,01 m.s-1 et une pression transmembranaire de 0,15 MPa. Cette meilleure résistance est liée à une augmentation des teneurs en acides gras C16:0, 18:1 et cycC19:0, ainsi qu'à une réduction de la concentration en C14:0. Les résultats des analyses protéomiques montrent aussi que les cellules les plus actives et les plus résistantes voient leur métabolisme énergétique augmenter, alors que leur métabolisme général et azoté est, au contraire, réduit. Finalement, ce travail propose deux voies intéressantes pour l'adaptation de Lb. bulgaricus CFL1, en vue d'améliorer sa cryotolérance. Certaines réponses physiologiques générales induisant ces adaptations cellulaires ont pu être identifiées, aux niveaux membranaire et cytoplasmique.
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