Imagerie du collagène par microscopie multiphotonique.
Résumé
The development of new tools and new techniques for biology and Medicine has always been an engine for research in microscopy. The first microscopes Antony von Leeuwenhoek enabled in 1677 discovered bacteria, sperm and red blood cells and today we seek to visualize intracellular processes, protein interaction, the interaction of cells in tissue ... Each year new techniques appear to show smaller, more specific, more physiological. The optics laboratory and the biosciences in which I conducted my dissertation focuses particularly multiphoton microscopy. This type of microscopy, who re- posed on the nonlinear interactions between matter and light, is mainly used today to follow fluorescent markers in tissues through the process of fluo- rescence in two-photon excitation. As such, it serves to supplement the confocal microscopy to view phenomena penetration depths that are inaccessible and allows to work across a fabric. However, multiphoton microscopy not limited to fluorescence excitation two photons, and it also gives access to nonlinear processes such as harmonic generation or the anti-Stokes Raman emission stimulated. These nonlinear interactions are still poorly used in biology and are subject Research in our laboratory. A non-linear processes studied in the laboratory is the second generation of har- Tableware (SHG). This was highlighted in 1961 by P. A. Franken [1] in crystals nonlinear and is widely used to double the frequency of lasers. In 1979, the trial- above has been applied in biology by Samuel Roth and Isaac Freund [2] on the tendons of rats which the organization of collagen yields the nonlinear effect. Almost thirty years have since this experiment, but the second-harmonic generation by collagen remains poorly understood. In addition, although many studies have shown the potential of this technique, it remains little used by biologists. This thesis, under the direction of Marie-Claire Schanne-Klein, wants to answer several questions: - What is the role of the organization of collagen in the submicrometer generation second harmonic signal? - What can make this technique in the visualization of collagen compared to other existing techniques? - What is the relevance of this technique to address biological problems cal? We focused on fibrosis is an abnormal accumulation of collagen tissues. A previous thesis done in our laboratory by Ana-Maria Pena avai already shown the potential of second harmonic generation to assess the severity of pulmonary fibrosis induced by bleomycin. However, these studies in collaboration tion with the pulmonology department of the Bichat hospital remained in a state demonstration principle. We then initiated a close collaboration with a team of nephro logues composed of Pierre Louis Tharaux, Monica and Cecilia Hernest Fligny (Cardiovascula Research Center INSERM U689 Lariboisière, France) working on the phenomenon mena of fibrosis in the kidney, and we applied the second-generation microscopy Harmonic this biomedical problem. In this manuscript, the first chapter introduces the biological concepts on collagen and fibrosis necessary for understanding the rest. The second chapter presents the various visualization techniques of collagen, emphasizes the principles and the device multiphoton microscopy and finally develops a model of signal generation is cond harmonic collagen observed by microscopy. We then in third chapter a methodology for quantifying renal fibrosis, we validate known a murine model of renal fibrosis. The last chapter is devoted to the application our methodology to various biological problems related to renal fibrosis.
Le développement de nouveaux outils et de nouvelles techniques pour la biologie et la médecine a toujours été un moteur pour la recherche en microscopie. Les premiers microscopes permirent à Antoine Von Leeuwenhoek en 1677 de découvrir les bactéries, les spermatozoïdes et les globules rouges et aujourd'hui nous cherchons à visualiser les processus intracellulaires, l'interaction des protéines, l'interaction des cellules dans les tissus... Chaque année de nouvelles techniques apparaissent pour voir plus petit, plus spécifique, plus physiologique. Le laboratoire d'optique et biosciences dans lequel j'ai effectué ma thèse s'intéresse plus particulièrement aux techniques de microscopie multiphoton. Ce type de microscopie, qui re- pose sur les interactions non linéaires entre la matière et la lumière, est principalement utilisé aujourd'hui pour suivre des marqueurs fluorescents dans les tissus grâce au processus de fluo- rescence sous excitation à deux photons. En cela, elle sert à suppléer la microscopie confocale pour visualiser des phénomènes à des profondeurs de pénétration qui lui sont inaccessibles, et permet ainsi de travailler sur l'ensemble d'un tissu. Toutefois, la microscopie multiphoton ne se borne pas à la fluorescence sous excitation à 2 photons ; elle donne aussi accès à des processus non linéaires comme la génération d'harmoniques ou l'émission Raman anti-Stockes stimulée. Ces interactions non linéaires sont encore peu utilisées en biologie et font l'objet de recherches dans notre laboratoire. L'un des processus non linéaires étudiés au laboratoire est la génération de second harmo- nique (SHG). Celle-ci a été mise en évidence en 1961 par P. A. Franken[1] dans des cristaux non linéaires et s'utilise couramment pour doubler la fréquence des lasers. En 1979, ce proces- sus a été appliqué en biologie par Samuel Roth et Isaac Freund[2] sur des tendons de rat où l'organisation du collagène permet d'obtenir l'effet non linéaire. Presque trente années se sont écoulées depuis cette expérience, mais la génération de second harmonique par le collagène reste mal comprise. De plus, même si de nombreuses études ont montré le potentiel de cette technique, elle reste peu utilisée par les biologistes. Cette thèse, sous la direction de Marie-Claire Schanne-Klein, veut répondre à plusieur questions : - Quel est le rôle de l'organisation submicrométrique du collagène dans la génération du signal de second harmonique ? - Que peut apporter cette technique dans la visualisation du collagène par rapport aux autres techniques déjà existantes ? - Quelle est la pertinence de cette technique pour répondre à des problématiques biolo gique ? Nous nous sommes focalisés sur la fibrose qui est une accumulation anormale de collagèn dans les tissus. Une thèse précédente réalisée dans notre laboratoire par Ana-Maria Pena avai déjà montré le potentiel de la génération de second harmonique pour évaluer la gravité d fibroses pulmonaires induites par la bléomycine. Toutefois, ces études réalisées en collabora tion avec le service de pneumologie de l'hôpital Bichat sont restées à l'état de démonstration de principe. Nous avons alors engagé une collaboration étroite avec une équipe de néphro logues composée de Pierre Louis Tharaux, Monica Hernest et Cécile Fligny (Cardiovascula Research Center Inserm Lariboisière INSERM U689, France) qui travaillent sur les phéno mènes de fibroses dans le rein, et nous avons appliqué la microscopie par génération de second harmonique à cette problématique biomédicale. Dans ce manuscrit, le premier chapitre introduit les notions biologiques sur le collagèn et la fibrose nécessaires à la compréhension de la suite. Le deuxième chapitre présente le diverses techniques de visualisation du collagène, insiste sur les principes et le dispositif d microscopie multiphoton et enfin développe une modélisation du signal de génération de se cond harmonique par le collagène observé en microscopie. Nous proposons ensuite dans l troisième chapitre une méthodologie pour quantifier la fibrose rénale, que nous validons su un modèle murin de fibrose rénale. Enfin, le dernier chapitre est consacré à l'application d notre méthodologie à diverses problématiques biologiques liées à la fibrose rénale.