Design of fluorescence immunoassays. Perspectives for continuous monitoring of biological warfare agents.
DÉVELOPPEMENT DE DOSAGES IMMUNOLOGIQUES PAR FLUORESCENCE. Perspectives pour l'élaboration d'un capteur en flux des agents de la menace.
Résumé
This thesis was devoted to the design of fluorescence immunoassays aiming at the detection of biological warfare agents. We developed a new concept of competitive immunoassay for continuous flow detection involving a fluorescence resonance energy transfer (FRET). This procedure is based on the use of an heterotrifunctional reagent (tripod) bearing i) a fluorophore donor (D), ii) a molecule structurally close to the target and iii) a linker to the solid phase. The binding of an anti-target antibody labeled with an acceptor molecule (A) on the tripod generates the decrease of the donor emission via the FRET phenomenon (quenching). The presence of the target competiting with the tripod for the binding to the antibody leads to an increase of the fluorescence signal. The solid phase can be easily further reactivated by adding the labeled antibody. This method was evaluated in microtiter plates using small molecules (substance P, atrazine, aflatoxine) and larger proteins (β-lactoglobuline, botulinum toxin, ricin). Spectral properties of the dyes, A/D ratio and A-D distance were demonstrated to have largely influenced FRET efficiency and hereby the sensitivity of the assay. The sensitivity also strongly depends on the binding characteristics of the antibody. The main difficulty lies on the relative affinity characteristics of the antibody towards the tripod and the analyte, since the antibody should exhibit ideally a strong affinity for the tripod and even stronger affinity for the analyte. Assays performed in glass microcells using a CCD camera and a fluorescence microscope allowed continuous-flow detection and are promising for the build-up of a biosensor. We also present a simple method for performing rapid assays in microtiter plates thanks to the difference in fluorescence signal observed between free and immobilized dyes which proved to be efficient for the design of a simultaneous multiplexed immunoassay.
Cette thèse s'inscrit dans le cadre de la recherche de procédés de détection rapides et sensibles des agents de la menace biologique. Nous avons étudié une nouvelle méthode de dosage immunologique par transfert d'énergie par résonance de fluorescence (FRET) adaptable à un dosage en flux. Cette méthode est basée sur l'emploi d'un réactif trifonctionnel (tripode) comportant i) un fluorophore Donneur (D), ii) un analogue de la molécule à doser (analyte) et iii) une fonction permettant son immobilisation sur une phase solide. La liaison d'un anticorps anti-analyte marqué avec un fluorophore Accepteur (A) entraîne une diminution de la fluorescence de D (quenching). La présence de l'analyte induit une compétition pour la liaison de l'anticorps avec le tripode et restaure ainsi la fluorescence de D. Le procédé permet d'obtenir un signal localisé et cumulatif et la réalisation de dosages successifs sur une même surface régénérée par ajout d'anticorps. L'évaluation du procédé a été effectuée en plaque de microtitration sur des petites molécules (substance P, atrazine, aflatoxine) et des protéines (β-lactoglobuline, toxine botulinique, ricine). Les propriétés spectrales des fluorophores, le rapport A/D et la distance A-D conditionnent fortement l'efficacité du FRET et donc la sensibilité du dosage qui dépend toutefois surtout des caractéristiques d'affinité relatives de l'anticorps envers l'analyte et envers le tripode. Idéalement l'anticorps devrait présenter une bonne affinité pour le tripode et une encore meilleure pour l'analyte. Des essais de mesure avec circulation de fluide, effectués dans une microcellule en verre en employant comme détecteur une caméra CCD montée sur un microscope à fluorescence, ont montré la faisabilité d'une détection en flux et permettent d'envisager le développement d'un biocapteur fonctionnant selon ce principe. Un autre procédé basé sur la discrimination des fluorophores en solution et immobilisés est également présenté, permettant de développer un dosage rapide et simultané de plusieurs composés.
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