Immobilisation de la trypsine sur un support de polyéthylène fonctionnalisé par voie plasma
Résumé
Cold plasma processing is a very efficient technique to modify the surface of polymers without changing their bulk properties. By this way, the immobilization of enzymes on inert supports becomes possible. In this work different plasma processes (mixture of nitrogen and hydrogen, ammonia, and allylamine) were selected in order to generate primary amine functions on the surface of low density polyethylene (PE) films. The activation of the surface by amino groups was followed by a reaction with glutaraldehyde as homobifunctional cross-linking agent leading to the first imine linkage. The enzyme was then reacted with free aldehyde functions and fixed to the surface via lysine residues (imine bond). In some cases, the reduction of the imine bonds by sodium cyanoborohydride was performed to form the stable secondary amines. The activity of the trypsin immobilized on the PE disks was assayed by kinetic measurement of N-α-Benzoyl-L-Arginine Ethyl Ester (BAEE) hydrolysis. The surface composition of the modified polyethylene samples was characterized by X-ray photoelectron spectroscopy (XPS) and confirms the composition of the different layers fixed on to the surface of PE. In order to check the strength of immobilization, different washing solutions were used. Active trypsin was successfully immobilized on the surface of polyethylene with a maximal value of activity equal to 0.080 U/cm2 and no enzyme was released during the reaction. We also studied the stability of the immobilized enzyme during repetitive assays (4 assays) which showed a decrease of activity over a period of two months.
La technologie plasma basse pression est utilisée pour contrôler les modifications des propriétés physico-chimiques de surface des polymères, sans altérer les propriétés de coeur des matériaux. Nous avons utilisé cette technique pour activer des films de polyethylène (PE) dans afin d'immobiliser des biomolécules à leur surface. Différents types de plasma basse pression ont été mis en oeuvre afin d'incorporer des fonctions aminées, en particulier des amines primaires à la surface: plasma ammoniac, N2 + H2 et allylamine. Dans une deuxième étape, on a fait réagir le dialdéhyde glutarique (glutaraldéhyde) avec les fonctions amines primaires de la surface (formation de liaisons imines), afin qu'il joue le rôle de bras espaceur. Enfin, la dernière étape consiste en l'immobilisation covalente de la trypsine via la réaction de l'extrémité libre du bras avec les groupements amine primaire portés par l'enzyme (résidus lysine). Dans certaines expériences, la réduction des fonctions imine en amine secondaire a été effectuée à l'aide du cyanoborohydrure de sodium. L'analyse XPS a permis de caractériser chaque étape de fixation, de la surface traitée par plasma jusqu'à l'enzyme immobilisée. Différents protocoles de rinçage des échantillons ont été testés afin de s'assurer de la bonne immobilisation de l'enzyme. L'activité enzymatique a été mesurée en suivant les cinétiques de dégradation du substrat N-α-Benzoyl-L-Arginine Ethyl Ester (BAEE). On a pu ainsi mettre en évidence une activité enzymatique d'environ 0,08 U/cm2 sur les échantillons traités subissant l'étape de réduction, sans relargage d'enzyme pendant les essais. L'étude de la stabilité de l'activité au cours du temps et au cours d'essais répétitifs montre une activité significative pour le deuxième essai et une décroissance progressive jusqu'au 4ème, soit après une période d'environ 2 mois.
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