Aptamers and Capillary Electrophoresis: physico-chemical characterization of free aptamers in solution or grafted on nanoparticles, and study of their affinity towards a proteic target in view of their use in sensitive diagnosis methods - Archive ouverte HAL Access content directly
Theses Year : 2010

Aptamers and Capillary Electrophoresis: physico-chemical characterization of free aptamers in solution or grafted on nanoparticles, and study of their affinity towards a proteic target in view of their use in sensitive diagnosis methods

Aptamères et électrophorèse capillaire : caractérisation physico-chimique d'aptamères libres en solution ou greffés sur des nanoparticules, et étude de leur affinité avec une cible protéique en vue de leur emploi pour des méthodes sensibles de diagnostic

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Abstract

Aptamers are short oligonucleotides selected by SELEX (systematic evolution of ligands by exponential enrichment) and showing great affinity and specificity towards their target. This work deals with the physico-chemical characterization of aptamers and the study of their affinity towards their target, using capillary electrophoresis, through the example of an aptamer selected against a highly basic protein, lysozyme. After having evaluated several modifications of the capillary surface, the permanent coating with hydroxypropylcellulose was chosen in order to minimize protein adsorption while being compatible with the aptamer analysis. The electrophoretic behavior of the aptamer in presence of various cations in solution was then studied using affinity capillary electrophoresis (ACE), showing in case of a dication a significant interaction which could induce a conformational change of the aptamer, and thus influence the interaction with the target. The development of frontal analysis continuous microchip electrophoresis (FACMCE) with fluorescence detection enabled to determine the interaction parameters between lysozyme and its aptamer, as well as the influence of experimental conditions on the binding affinity. Lastly, magnetic fluorescent core-shell nanoparticles were fonctionnalized with the aptamer and characterized by capillary zone electrophoresis (CZE). The FACMCE analysis of the binding between the grafted aptamer and lysozyme showed an affinity similar to those of the free aptamer, enabling to consider the future use of these objects as molecular recognition tools.
Les aptamères sont de courts oligonucléotides sélectionnés par le procédé SELEX (systematic evolution of ligands by exponential enrichment), présentant une affinité et une spécificité élevée pour leur cible. Ce travail porte sur la caractérisation physico-chimique d'aptamères et l'étude de leur affinité avec leur cible, par électrophorèse capillaire, à travers l'exemple d'un aptamère dirigé contre une cible protéique fortement basique, le lysozyme. Après évaluation de différents traitements de surface du capillaire, la modification permanente par l'hydroxypropylcellulose a été retenue afin de limiter l'adsorption protéique tout en restant compatible avec l'analyse de l'aptamère. Le comportement électrophorétique de l'aptamère en présence de différents cations en solution a ensuite été étudié par électrophorèse capillaire d'affinité (ACE), mettant en évidence dans le cas d'un dication une interaction significative pouvant induire un changement de conformation de l'aptamère, et donc susceptible d'influer sur l'interaction avec la cible. Le développement d'une méthode d'analyse frontale électrocinétique en microsystème (FACMCE) avec détection de fluorescence a permis de déterminer les paramètres de l'interaction aptamère-lysozyme, ainsi que l'influence des conditions expérimentales sur l'affinité. Enfin, des nanoparticules magnétiques fluorescentes cœur/coquille ont été fonctionnalisées par l'aptamère puis caractérisées par électrophorèse capillaire de zone (CZE). L'étude par FACMCE de l'interaction entre l'aptamère greffé et le lysozyme a montré une affinité similaire à celle de l'aptamère libre, permettant ainsi d'envisager l'utilisation future de ces objets comme outils de bio-reconnaissance moléculaire.
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pastel-00553765 , version 1 (09-01-2011)

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  • HAL Id : pastel-00553765 , version 1

Cite

Marie Girardot. Aptamères et électrophorèse capillaire : caractérisation physico-chimique d'aptamères libres en solution ou greffés sur des nanoparticules, et étude de leur affinité avec une cible protéique en vue de leur emploi pour des méthodes sensibles de diagnostic. Chimie analytique. Université Pierre et Marie Curie - Paris VI, 2010. Français. ⟨NNT : ⟩. ⟨pastel-00553765⟩
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