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Theses Year : 2012

Nonlinear microscopy of biological tissues: multicolor excitation, Bessel beams and light sheet microscopy

Microscopie non linéaire de tissus biologiques : excitation multicouleur, faisceaux de Bessel, et excitation en nappe de lumière

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1
Pierre Mahou
  • Function : Author
  • PersonId : 943089

Abstract

This work aimed at developing novel strategies in nonlinear microscopy to increase the number of avalaible contrasts and the imaging speed. Firstly, we investigated the use of synchronized pulse trains for multimodal nonlinear microscopy. We showed that this configuration allows the simultaneous and effective two photon excitation of blue, green-yellow and red fluorescent proteins. We have applied this technique to image large volume of Brainbow labeled tissues to develop strategies for mapping neural networks and reconstructing cell lineage trees in the central nervous system. More generally, we showed that synchronized pulse trains provide access to a broad range of nonlinear optical effects such as: two photon excited fluorescence (2PEF), second (SHG) and third harmonic (THG) generation and four-wave mixing (FWM). We then investigated strategies to increase the imaging frame rate of nonlinear microscopes. For this purpose, we first designed and built optical schemes that rely on Bessel beams in order to increase the depth of field of raster scanning microscopes. Finally, to potentially increase the imaging frame rate without degrading the optical sectionning we developped a nonlinear light sheet microscope with programmable excitation beam shape. Using this microscope, we compared the imaging properties of different excitation profiles (Gauss and Bessel) for applications to embryo imaging.
Le travail effectué au cours de cette thèse a porté sur le développement et la mise en œuvre de nouvelles stratégies en microscopie non linéaire permettant d'augmenter le nombre de signaux non linéaires simultanément observables d'une part, et la vitesse d'acquisition d'autre part. Dans un premier temps, nous avons exploré la possibilité de produire des signaux multiples au moyen de deux trains d'impulsions synchronisés de longueur d'onde centrale distincte. Nous avons montré que cette approche permet d'exciter de façon optimale et simultanée trois protéines fluorescentes respectivement bleue, jaune, et rouge. Une application de cette méthode consiste à imager de grands volumes de tissus marqués avec des transgènes Brainbow dans le but d'étudier la connectivité ou le lignage cellulaire. Plus généralement, nous avons montré que cette approche permet de combiner plusieurs signaux non linéaires tels que la fluorescence, la génération de seconde (SHG) et de troisième (THG) harmoniques, ainsi que le mélange à quatre ondes (FWM). Dans un deuxième temps, nous avons étudié la possibilité d'augmenter la vitesse d'imagerie. Pour cela, nous avons mis en œuvre plusieurs manières de produire des faisceaux de Bessel focalisés afin d'augmenter la profondeur de champ d'un microscope à balayage. Enfin, en vue d'augmenter la vitesse d'acquisition tout en préservant le sectionnement optique, nous avons construit un microscope biphotonique à nappe de lumière de profil spatial programmable. Dans cette géométrie nous avons comparé les propriétés d'imagerie de profils d'excitation de type gaussien et de Bessel pour des applications en biologie du développement.
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Dates and versions

pastel-00840186 , version 1 (01-07-2013)

Identifiers

  • HAL Id : pastel-00840186 , version 1

Cite

Pierre Mahou. Microscopie non linéaire de tissus biologiques : excitation multicouleur, faisceaux de Bessel, et excitation en nappe de lumière. Optique [physics.optics]. Ecole Polytechnique X, 2012. Français. ⟨NNT : 2597046289B⟩. ⟨pastel-00840186⟩
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