Ligand transfer in heme proteins studied by impulsive infrared spectroscopy
Spectroscopie infrarouge impulsionnelle appliquée au transfert de ligands dans les hémoprotéines
Résumé
Ligand transfer (of diatomics such as O2, CO, NO, CN...)in heme proteins is an integral part of many biological functions such as storage and ligand transport, enzymatic catalysis and ligand detection. A thorough knowledge of these mechanisms underlying the ligand transfer from the heme binding site to the protein exterior is essential to understand how these heme proteins accomplish their function : discriminate between ligands, shuttle them from the solvent to the heme pocket and vice versa, and react to external signals.
The ligand transfer from the heme binding site to the exterior of the protein involves different stages with timescales spanning several orders of magnitude. Our study deals with the very first events of the ligand transfer which occur on the femtosecond timescale. In the case of myoglobin case, this event is the transfer of the ligand from the heme to a nearby site called docking-site, which is the first site the ligand reaches on its way to the solvent.
We monitor this transfer using infrared (5 µm) femtosecond pulses which directly probe the CO ligand vibrational changes during the transfer. The vibrational dephasing time of the CO ligand (1 picosecond) is longer than the dynamics of the transfer. Therefore, coherent effects arise and forbid a direct interpretation of spectrally resolved transmission experiments at short pump-probe time delays. We avoid these effects by using two complementary methods. In a first experimental configuration, the transmission of the sample is spectrally integrated, we are thus insensitive to coherent effects. In such a scheme, a very sensitive detection is required in order to access the weak differential signal. In a second experimental configuration, we monitor the ligand vibration during the transfer by recording the emitted field of the CO. The homodyne detection of this field requires phased-locked mid-IR pulses.
We developed a non-stationary response function which describes the sample response and allows the simulation of these two kinds of experiments. We also introduce a novel time-frequency representation of the non-stationary response function.
We performed experiments on myoglobin, a reference system for the ligand transfer study. In this protein, spectrally integrated differential transmission experiments showed a progressive
decay of the oscillator strength of the ligand during the transfer. Simulations based on a phenomenological model support this interpretation. Surprisingly, the oscillator strength
change does not follow the quasi-instantaneous vibrational frequency change. To our knowledge, this is the first report on a progressive decay of the vibrational oscillator strength following the breaking of a chemical bond. This oscillator strength correlated to heme-ligand distance is a potential probe of the ligand transfer.
The ligand transfer from the heme binding site to the exterior of the protein involves different stages with timescales spanning several orders of magnitude. Our study deals with the very first events of the ligand transfer which occur on the femtosecond timescale. In the case of myoglobin case, this event is the transfer of the ligand from the heme to a nearby site called docking-site, which is the first site the ligand reaches on its way to the solvent.
We monitor this transfer using infrared (5 µm) femtosecond pulses which directly probe the CO ligand vibrational changes during the transfer. The vibrational dephasing time of the CO ligand (1 picosecond) is longer than the dynamics of the transfer. Therefore, coherent effects arise and forbid a direct interpretation of spectrally resolved transmission experiments at short pump-probe time delays. We avoid these effects by using two complementary methods. In a first experimental configuration, the transmission of the sample is spectrally integrated, we are thus insensitive to coherent effects. In such a scheme, a very sensitive detection is required in order to access the weak differential signal. In a second experimental configuration, we monitor the ligand vibration during the transfer by recording the emitted field of the CO. The homodyne detection of this field requires phased-locked mid-IR pulses.
We developed a non-stationary response function which describes the sample response and allows the simulation of these two kinds of experiments. We also introduce a novel time-frequency representation of the non-stationary response function.
We performed experiments on myoglobin, a reference system for the ligand transfer study. In this protein, spectrally integrated differential transmission experiments showed a progressive
decay of the oscillator strength of the ligand during the transfer. Simulations based on a phenomenological model support this interpretation. Surprisingly, the oscillator strength
change does not follow the quasi-instantaneous vibrational frequency change. To our knowledge, this is the first report on a progressive decay of the vibrational oscillator strength following the breaking of a chemical bond. This oscillator strength correlated to heme-ligand distance is a potential probe of the ligand transfer.
Le transfert de ligands (de petites molécules telles que l'oxygène, NO, CO ou CN) dans les hémoprotéines est un processus situé au cœur de nombreuses fonctions biologiques : stockage et transport de ligands, catalyse enzymatique, ou encore détection de ligands. L'aptitude de ces protéines à accomplir leur fonction s'appuie en particulier sur leur capacité à discriminer les différents ligands et à les transférer de façon réversible de l'hème vers le solvant.
Les différentes étapes du transfert de ligand du site de liaison, l'hème, à l'extérieur de la protéine, ont lieu sur des échelles de temps couvrant plusieurs ordres de grandeur. Notre étude concerne les premières étapes du transfert de ligand qui se déroulent à l'échelle femtoseconde. Il s'agit dans le cas de la myoglobine du passage du ligand de l'hème à un site voisin à l'intérieur de la poche de l'hème (dit docking-site). Nous accédons au transfert grâce à une sonde située dans le domaine infrarouge moyen (5 µm). Ainsi, nous sommes directement sensibles aux changements de la vibration du ligand CO au cours du transfert.
Le temps de déphasage vibrationnel du ligand CO (1 picoseconde) est long devant la dynamique du transfert. Ceci est à l'origine d'effets de cohérence et interdit, aux temps courts, une interprétation simple des expériences de transmission résolues spectralement. Afin de s'affranchir de ces effets, nous avons mis en place et utilisé deux méthodes complémentaires. Dans une première configuration expérimentale, la transmission de l'échantillon est intégrée spectralement, l'obtention du signal faible a nécessité une détection d'une grande sensibilité. Dans une deuxième configuration, nous accédons à la vibration du ligand au cours du transfert par la détection homodyne du champ émis par le ligand au cours du transfert. Cette approche originale de détection du champ émis a nécessité la stabilisation en phase d'une séquence d'impulsions infrarouge.
Nous avons développé une fonction de réponse non-stationnaire qui décrit la réponse de l'échantillon et permet la simulation de ces deux types d'expériences. Nous présentons également une représentation spectro-temporelle originale de la réponse non-stationnaire.
Nous avons mené des expériences sur la myoglobine, une hémoprotéine qui est un système de référence pour l'étude du transfert de ligand. Dans cette protéine, nos expériences de transmission différentielle intégrée spectralement ont permis d'observer une diminution progressive de la force d'oscillateur du ligand au cours du transfert. Cette interprétation est confirmée par des simulations basées sur un modèle phénoménologique. De façon surprenante, cette variation de force d'oscillateur ne suit pas le changement quasi-instantanée de la fréquence vibrationnelle. A notre connaissance, il s'agit de la première observation d'une diminution progressive de la force d'oscillateur vibrationnelle suite à la rupture d'une liaison chimique. Corrélée à la distance hème-ligand, cette force d'oscillateur est potentiellement une sonde du transfert de ligand.
Les différentes étapes du transfert de ligand du site de liaison, l'hème, à l'extérieur de la protéine, ont lieu sur des échelles de temps couvrant plusieurs ordres de grandeur. Notre étude concerne les premières étapes du transfert de ligand qui se déroulent à l'échelle femtoseconde. Il s'agit dans le cas de la myoglobine du passage du ligand de l'hème à un site voisin à l'intérieur de la poche de l'hème (dit docking-site). Nous accédons au transfert grâce à une sonde située dans le domaine infrarouge moyen (5 µm). Ainsi, nous sommes directement sensibles aux changements de la vibration du ligand CO au cours du transfert.
Le temps de déphasage vibrationnel du ligand CO (1 picoseconde) est long devant la dynamique du transfert. Ceci est à l'origine d'effets de cohérence et interdit, aux temps courts, une interprétation simple des expériences de transmission résolues spectralement. Afin de s'affranchir de ces effets, nous avons mis en place et utilisé deux méthodes complémentaires. Dans une première configuration expérimentale, la transmission de l'échantillon est intégrée spectralement, l'obtention du signal faible a nécessité une détection d'une grande sensibilité. Dans une deuxième configuration, nous accédons à la vibration du ligand au cours du transfert par la détection homodyne du champ émis par le ligand au cours du transfert. Cette approche originale de détection du champ émis a nécessité la stabilisation en phase d'une séquence d'impulsions infrarouge.
Nous avons développé une fonction de réponse non-stationnaire qui décrit la réponse de l'échantillon et permet la simulation de ces deux types d'expériences. Nous présentons également une représentation spectro-temporelle originale de la réponse non-stationnaire.
Nous avons mené des expériences sur la myoglobine, une hémoprotéine qui est un système de référence pour l'étude du transfert de ligand. Dans cette protéine, nos expériences de transmission différentielle intégrée spectralement ont permis d'observer une diminution progressive de la force d'oscillateur du ligand au cours du transfert. Cette interprétation est confirmée par des simulations basées sur un modèle phénoménologique. De façon surprenante, cette variation de force d'oscillateur ne suit pas le changement quasi-instantanée de la fréquence vibrationnelle. A notre connaissance, il s'agit de la première observation d'une diminution progressive de la force d'oscillateur vibrationnelle suite à la rupture d'une liaison chimique. Corrélée à la distance hème-ligand, cette force d'oscillateur est potentiellement une sonde du transfert de ligand.
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