Clonage et expression des prochymosines bovines A, B et B S79N chez Escherichia coli et Pichia pastoris. Etude de la mutation S79N - Archive ouverte HAL Access content directly
Theses Year : 2004

Clonage et expression des prochymosines bovines A, B et B S79N chez Escherichia coli et Pichia pastoris. Etude de la mutation S79N

(1)
1

Abstract

Chymosin, an enzyme used in cheese manufactures as a milk-clotting agent, is traditionaly prepared from the fourth stomach of unweaved calves. This crude preparation called rennet has been substituted by microbial and plant coagulants for years since chymosin production was unable to satisfy the world demand especially due to the increase of cheese production. However, chymosin still remains the better milk-clotting enzyme. Thus, genetic engineering techniques are used to produce recombinant bovine chymosin. Using these techniques, we propose to establish the conditions for production of recombinant bovine chymosin, allowing technological innovation and contributing to the development of food industry of Brazil and countries of the Economic Market of “Cone Sul” (MercoSul).
La chymosine, enzyme utilisée dans l´industrie fromagère pour coaguler le lait, est traditionnellement extraite à partir du quatrième estomac de veaux non sevrés. La préparation ainsi obtenue dénommée présure a été depuis un certain nombre d´années substituée par divers coagulants d´origine microbienne et de plantes car la production de cette enzyme seule n´était plus capable de répondre à la demande mondiale du fait notamment de l´augmentation de la production fromagère. La chymosine est cependant toujours considérée comme étant la meilleure enzyme pour coaguler le lait dans l´industrie fromagère. Ainsi, les techniques d´ingénierie génétique ont été utilisées pour produire de la chymosine bovine recombinante. C´est en utilisant ces techniques que nous proposons d´établir un procédé de production de chymosine bovine recombinante permettant l'innovation technologique et contribuant au maintien et au développement d'entreprises agro-alimentaires brésiliennes et des pays du Marché Economique du « Cone Sul » (MercoSul).
Nous avons ainsi cloné les séquences codant la préprochymosine A et la préprochymosine B à l'aide des techniques classiques de biologie moléculaire. Nous avons observé la présence de mutations dans la partie du propeptide de la prochymosine A et dans la partie mature de la prochymosine B. Cette dernière mutation, S79N, se situe dans la partie du tampon (résidus 72 à 86) qui constitue une anse externe mobile recouvrant le sillon du site actif. La conformation de ce tampon est caractéristique de la chymosine et serait en partie responsable pour sa grande spécificité. Nous avons modélisé cette mutation, qui semble entraîner des changements dans le réseau de liaisons hydrogène du tampon. Les séquences obtenues ont ainsi été introduites dans différents vecteurs d´expression puis clonées chez Escherichia coli et Pichia pastoris. L'expression des protéines a été suivie à l'aide d'anticorps spécifiques et au moyen de tests d'activité. Les différentes protéines sont toutes actives et ont été purifiées à l'homogénéité. Nous avons alors étudié leurs propriétés cinétiques à l'aide de différents substrats. Les chymosines B et BS79N ont un optimum de pH qui les différencie de la chymosine A. Le mutant B S79N a des propriétés cinétiques améliorées avec l´hexapeptide synthétique. La mutation S79N n´entraîne toutefois qu´une petite augmentation de la constante d´efficacité concernant les hydrolyses de la caséine Κ et du lait, bien que ses vitesses de réactions catalytiques soient supérieures à celles de la chymosine B. Ces résultats sont expliqués par les modifications dans le réseau de liaisons hydrogène du tampon, et par le fait que le nombre d'interactions entre le substrat et l'enzyme est une fonction de la masse moléculaire et de la nature du substrat.
Fichier principal
Vignette du fichier
tel-00005681.pdf (6.33 Mo) Télécharger le fichier

Dates and versions

tel-00005681 , version 1 (30-11-2004)

Identifiers

  • HAL Id : tel-00005681 , version 1

Cite

Alexandra Abreu da Silva. Clonage et expression des prochymosines bovines A, B et B S79N chez Escherichia coli et Pichia pastoris. Etude de la mutation S79N. Biochimie [q-bio.BM]. INAPG (AgroParisTech), 2004. Français. ⟨NNT : 2004INAP0001⟩. ⟨tel-00005681⟩

Collections

PASTEL PARISTECH
494 View
1343 Download

Share

Gmail Facebook Twitter LinkedIn More