Fluorescence microscopy under two-photon excitation : application to correlation and fluorescence lifetime analysis in biological samples. - Archive ouverte HAL Access content directly
Theses Year : 2001

Fluorescence microscopy under two-photon excitation : application to correlation and fluorescence lifetime analysis in biological samples.

microscopie de fluorescence par excitation à deux photons : application à des études de corrélations et de déclins de fluorescence en milieu biologique

(1)
1

Abstract

This thesis presents the development of a fluorescence microscope based on the non linear process of two-photon absorption. This new type of fluorescence microscopy characterized by a intrinsic three-dimensional spatial resolution comparable to those of the confocal microscope, offers also many advantages for biological studies, in particular in terms of restriction of the photodamages. Combined with time resolved techniques, two-photon microscopy allows imaging with high space and time resolutions and opens up new opportunities for biological dynamics studies. In this context, two time resolved techniques for fluorescence analysis under two-photon excitation have been developed. The first time resolved technique, the fluorescence correlation microscopy, based on measurements in micro-volumes with weak molecular concentration, has been essentially applied to the study of translational diffusion processes. In particular, the technique has allowed the determination, at the single molecule level, of the diffusion coefficient of various fluorescent biological probes : FITC-dextran, GFP (Green Fluorescent Protein) and fluoresceine. Moreover, our two-photon fluorescence correlation technique has been originally applied to the study molecular diffusion processes inside bacterial biofilms A second time resolved technique, fluorescence lifetime imaging under two-photon excitation, have been developed. The fluorescence lifetime, or lifetime of the first singlet excited state is an important characteristic of the physico-chemical state and of the environment of a molecule. Thus, measurement of fluorescence lifetime can provide quantitative information about the system under study and can bring fundamental information on intracellular mechanisms. The first results obtained with this technique applied in the pharmacological domain to the study of molecule activity in vitro and in vivo are presented.
Ce mémoire présente la mise en place d'un système complet de microscopie de fluorescence basé sur le processus non linéaire d'absorption à deux photons. Cette technique récente de microscopie biphotonique est caractérisée par de nombreux avantages pour l'étude d'échantillons biologiques, notamment en terme de limitation des photodommages. Combinée à des méthodes d'analyse de la dynamique d'émission de fluorescence, elle permet l'étude à la fois spatiale et temporelle de l'émission de fluorescence. Dans ce contexte, nous avons développé deux techniques d'analyse résolue en temps de la fluorescence. Une première technique d'analyse dynamique, la microscopie de corrélation de fluorescence, basée sur des mesures en micro-volume et sur une faible concentration moléculaire, a essentiellement été appliquée à l'étude du processus de diffusion translationnelle. En particulier, la microscopie de corrélation de fluorescence a permis, avec la sensibilité de détection d'une molécule unique, la détermination des coefficients de diffusion de sondes souvent utilisées en biologie : le FITC-dextran, la GFP (Green Fluorescent Protein) et la fluorescéine. Les performances de cette technique pour les études en milieux biologiques ont par ailleurs été validées par une application novatrice et originale à l'étude des mécanismes de la diffusion moléculaire au sein de biofilms de bactéries. Une deuxième technique d'analyse dynamique, l'imagerie des durées de vie fluorescence sous excitation à deux photons a été développée. La durée de vie de fluorescence d'une molécule, ou durée de vie de l'état excité singulet, est un paramètre caractéristique de l'état physico-chimique et de l'environnement d'une sonde fluorescente. Elle renseigne donc sur de nombreuses propriétés moléculaires essentielles à la compréhension des mécanismes intracellulaires. De premières applications concluantes de cette technique sont présentées, notamment des études in vitro de la réactivité de molécules d'intérêt pharmacologique ainsi que de premières mesures réalisées in vivo.
Fichier principal
Vignette du fichier
tel-00010025.pdf (2.82 Mo) Télécharger le fichier
Loading...

Dates and versions

tel-00010025 , version 1 (02-09-2005)

Identifiers

  • HAL Id : tel-00010025 , version 1

Cite

Elvire Guiot. microscopie de fluorescence par excitation à deux photons : application à des études de corrélations et de déclins de fluorescence en milieu biologique. Biophysique [physics.bio-ph]. Université Paris Sud - Paris XI, 2001. Français. ⟨NNT : ⟩. ⟨tel-00010025⟩
507 View
9594 Download

Share

Gmail Facebook Twitter LinkedIn More