Développement instrumental pour la microscopie de fluorescence résolue en temps: applications biomédicales
Instrumental development for fluorescence lifetime imaging microscopy: biomedical applications
Résumé
For several biomedical issues, including neurobiology, imaging with high spatial and temporal resolution in a physiologically relevant cellular context is necessary. To address these requirements, we have developed an original setup which associates total internal reflection fluorescence (TIRF) and fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM). Indeed, FLIM allows a dynamic analysis of molecular and metabolic processes within cells. Combined with TIRF microscopy, which provides a sub-wavelength axial resolution, FLIM enables to analyze the activity of cell membrane, with efficient fluorescent background rejection.
The first aim of this project was to develop a fluorescence excitation source dedicated to lifetime measurement in time domain. We worked on a solution based on a solid state picosecond laser, and we used microstructured optical fibers to enlarge the spectrum by non linear effects. The second aspect of this work was the development and the characterization of the time-gated total internal reflection fluorescence microscope, which allows to measure fluorescence lifetime in wide field. Then, we used this setup to study using FRET probes the homodimerization of amyloid precursor protein (APP), which plays a crucial role in Alzheimer disease.
The first aim of this project was to develop a fluorescence excitation source dedicated to lifetime measurement in time domain. We worked on a solution based on a solid state picosecond laser, and we used microstructured optical fibers to enlarge the spectrum by non linear effects. The second aspect of this work was the development and the characterization of the time-gated total internal reflection fluorescence microscope, which allows to measure fluorescence lifetime in wide field. Then, we used this setup to study using FRET probes the homodimerization of amyloid precursor protein (APP), which plays a crucial role in Alzheimer disease.
Pour certaines problématiques biomédicales, notamment en neurobiologie, l'imagerie des échantillons exige des résolutions spatiale et temporelle élevées, et seules des techniques de microscopie optique innovantes vont permettre d'imager la cellule dans des conditions physiologiques. Pour répondre à ces contraintes nous avons développé en intégralité un dispositif de microscopie de fluorescence en réflexion totale interne et résolue en temps. En effet, l'imagerie de fluorescence résolue en temps (FLIM) permet, en complément des informations de localisation et de topologie apportées par la microscopie conventionnelle, une analyse dynamique de processus moléculaires et métaboliques au sein des cellules. Associée à la technique de microscopie en réflexion totale interne, qui confère au système d'imagerie une résolution axiale sub-longueur d'onde tout en acquérant des images en champ large, la technique FLIM permet d'analyser l'activité membranaire des cellules en s'affranchissant de la fluorescence des autres entités de la cellule.
Ce travail s'est articulé autour de trois axes principaux : l'étude et le développement d'un dispositif d'excitation de la fluorescence basé sur un oscillateur laser solide picoseconde dont le spectre est élargi par effets non linéaires dans des fibres optiques microstructurées ; le développement et la caractérisation d'un dispositif de microscopie de fluorescence par onde évanescente (TIRF) couplé à une détection résolue en temps en plein champ ; et l'application de ce dispositif à l'étude d'un précurseur membranaire du peptide amyloïde impliqué dans la maladie d'Alzheimer.
Ce travail s'est articulé autour de trois axes principaux : l'étude et le développement d'un dispositif d'excitation de la fluorescence basé sur un oscillateur laser solide picoseconde dont le spectre est élargi par effets non linéaires dans des fibres optiques microstructurées ; le développement et la caractérisation d'un dispositif de microscopie de fluorescence par onde évanescente (TIRF) couplé à une détection résolue en temps en plein champ ; et l'application de ce dispositif à l'étude d'un précurseur membranaire du peptide amyloïde impliqué dans la maladie d'Alzheimer.