Investigation of Toxin-Cell Interactions and Receptor Confinement in the Cell Membrane
Investigation des Interactions Toxine-Cellule et du Confinement des Récepteurs dans la Membrane Cellulaire
Résumé
The cell membrane is the interface of communication and exchange between the
cell and the outside world. As such, its structure and composition is of integral
importance to the cell’s continued survival. The proteins within the membrane
provide the necessary functionalities to the membrane for successfully acting out
its role. The membrane receptors experience a highly heterogeneous environment
in the cell membrane that enhances their efficiency. We studied this environment
via single particle tracking of cell membrane receptors tagged with luminescent
lanthanide-doped nanoparticles. The nanoparticles provided a continuous,
uninterrupted signal of the movements, yielding trajectories of several minutes.
We then used a method based on statistical Bayesian inference to analyse and
compare the trajectories obtained and, hence, extract a confinement potential of
arbitrary shape.
We first validated the Bayesian inference approach by demonstrating that this
method can also be used to calibrate an optical tweezers setup. Furthermore, we
showed that this method outperforms established calibration methods for optical
traps. We then applied this approach to the confined trajectories of epsilon-toxin
(produced by Clostridium perfringens) receptors in Madin-Darby canine kidney
cells. In particular, we studied the evolution of the confinement potential and
diffusivity within the domains upon addition of domain-destabilizing agents, as
well as the occasional ‘hopping’ events, during which receptors are seen to hop
into an adjacent confinement domain, and the associated 'hopping' energies.
Additionally, we inquired into the effect of an externally applied force,
implemented via a hydrodynamic flow on the receptors, and discovered an actindependent
confinement of the microdomains in addition to the lipid-dependent
confinement.
To further investigate the nature of membrane receptor confinement, we
classified the potentials obtained from raft and non-raft proteins using a decisiontree
method and a clustering algorithm. The results showed that non-raft proteins
reside in domains that produce a steeper potential boundary with a flatter
potential in the centre of the domain as compared to raft proteins.
Finally, we extended the single-particle tracking of toxins to three dimensions by
registering the width of the point-spread function of the nanoparticle signal. In
this way, we were able to observe the internalization trajectory of a heavy-chain
segment of the botulinum toxin A of Clostridium botulinum in cells of the intestinal
mouse cell line m-ICcl2.
La membrane cellulaire est l’interface de communication et d’échange entre la
cellule et le monde extérieur. En tant que telle, sa structure et composition ont une
importance centrale à la viabilité de la cellule. Les protéines qui résident dans la
membrane apportent la fonctionnalité nécessaire pour permettre à la membrane
d’accomplir ces tâches. Ces récepteurs se retrouvent dans un environnement de
haute hétérogénéité qui renforce leur efficacité. Nous avons étudié cet
environnent en suivant des récepteurs uniques dans la membrane grâce aux
nanoparticules dopées aux terres rares. Ces nanoparticules produisent des
signaux continus, non-interrompus, permettant de suivre des trajectoires pendant
plusieurs minutes. Nous avons ensuite utilisé une méthode basée sur l’inférence
bayésienne pour analyser et comparer les trajectoires obtenues, et pour extraire
le potentiel de confinement de forme arbitraire correspondant à chaque
trajectoire.
Nous avons d’abord validé l’approche de l’inférence bayésienne en démontrant
que cette méthode peut également être utilisée pour la calibration d’un montage
de pinces optiques. Par ailleurs, nous avons démontré que cette approche est
supérieure aux techniques couramment utilisées pour la calibration des pinces
optiques. Puis, nous avons appliqué cette méthode aux trajectoires des récepteurs
de la toxine epsilon (de Clostridium perfringens) dans des cellules rénales canines Madin-
Darby (MDCK). En particulier, nous avons étudié l’évolution du potentiel de
confinement et de la diffusivité à l’intérieur des domaines confinant les récepteurs
pendant l’action d’un agent déstabilisant les domaines de confinement, ainsi que
les événement de ‘hopping’ pendant lesquels le récepteur change de domaine de
confinement, et déterminé les énergies de ‘hopping’ associées. De plus, nous
avons observé l’effet d’une force externe appliquée au récepteur, produite par un
flux hydrodynamique. L’application d’une force a mis en évidence une dépendance
du confinement des récepteurs du cytosquelette d’actine en plus du confinement
produit par la distribution des lipides.
Pour approfondir notre investigation du confinement des récepteurs de la
membrane, nous avons classifié les potentiels de confinement obtenus pour les
récepteurs résidant à l’intérieur et à l’extérieur des radeaux lipidiques. Les
potentiels ressentis par les récepteurs en dehors des domaines lipidiques sont
plus plats au centre du domaine de confinement et plus abrupts vers les bords du
domaine par rapport aux potentiels ressentis par les protéines dans les radeaux.
Enfin, nous avons étendu la technique de suivi de particules uniques en 3D en
utilisant la largeur de la fonction de réponse du signal de la nanoparticule. De cette
manière, nous avons observé le mouvement d’internalisation de nanoparticules
couplées à un fragment de la chaine lourde de la toxine botulique A de Clostridium
botulinum dans des cellules intestinales de souris de la lignée m-ICcl2.