Optical tweezers and phase contrast microscopy for the study of cell mechanics : experimental setup, modeling and calibration using backscattered light.
Pince optique et microscopie à contraste de phase pour l'étude de la mécanique cellulaire : développement, modélisation et calibration en réflexion.
Résumé
This manuscript details the development of an optical tweezer setup to study the mechanical properties of endothelial cells, involved in the development of atherosclerosis. The goal is to determine the viscoelastic properties of the cells, and to follow the propagation of the mechanical constraint inside the cell. This mechanical constraint is applied via a bead attached to the cell membrane and subjected to an optical trap.The setup built combines optical trapping with phase contrast microscopy, to apply a force while imaging the cells with the same microscope objective. The originality of the optical tweezer setup relies on the detection of the signal backscattered by the trapped bead, in a plane conjugate to the back focal plane of the objective, in order to measure the relative position of the bead with respect to the center of the trap.An important part of this work was dedicated to the understanding of the detected signal presenting an interference pattern with rings, explained by a simple model. This model provides an explanation for the position measurement artifacts arising from the superposition of the phase ring and the interference pattern. To solve the problem, the phase ring was moved in a conjugate plane involved only in the imaging path of the sample.The interference pattern has the main advantage of giving access to the precise height of the trapped bead, usually difficult to measure. This information is necessary to calibrate the optical trap stiffness at the height of the cells, either by the power spectrum analysis of the Brownian motion of the trapped bead, or by its response to a step motion of the trap. These two calibration methods, along with the application of the equipartition theorem and Bayesian inference analysis, were implemented and their results compared, showing a good agreement. The complete calibration of the setup makes it a ready-to-use tool to exert local forces controlled in direction and amplitude on cells.
Ce manuscrit détaille le développement d'un montage de pince optique permettant d'étudier les propriétés mécaniques des cellules endothéliales, impliquées dans le développement de l'athérosclérose. Le but est de déterminer les propriétés viscoélastiques des cellules, et de suivre la propagation d’une contrainte mécanique au sein de la cellule. Cette contrainte mécanique est appliquée via une bille liée à la membrane de la cellule et soumise à un piège optique.Le dispositif réalisé combine le piégeage optique et la microscopie à contraste de phase, permettant d'exercer une force tout en imageant les cellules via le même objectif de microscope. L'originalité du montage de pince optique repose sur la détection du signal rétrodiffusé par la bille piégée, dans un plan conjugué du plan focal arrière de l'objectif, afin de mesurer la position relative de la bille par rapport au piège.Une part importante de ce travail a consisté à comprendre l'allure du signal détecté présentant un système d'interférences en anneaux, et à l’expliquer par un modèle simple. Ce modèle a permis de comprendre la présence d’artefacts de mesure de position dus à la superposition de l'anneau de phase sur la figure d’interférence. Pour y remédier, l'anneau de phase est déporté dans un plan conjugué intervenant uniquement dans l'imagerie de l'échantillon.La figure d'interférence présente un atout majeur : elle donne accès à la hauteur précise de la bille piégée, généralement difficile à mesurer. Cette information est nécessaire pour calibrer la constante de raideur du piège optique à la hauteur des cellules, que ce soit par l'analyse de la densité spectrale de puissance du mouvement brownien de la bille piégée ou par sa réponse à un échelon de position du piège. Ces deux méthodes de calibration, ainsi que l'application du théorème d’équipartition et l'analyse par inférence bayésienne, ont été mises en œuvre. Tous les résultats s'avèrent en bon accord. La calibration complète du dispositif en fait un outil prêt à l'emploi pour exercer des forces locales contrôlées en direction et en amplitude sur les cellules.
Origine : Version validée par le jury (STAR)