Etude des erreurs programmées du ribosome par microscopie de fluorescence en molécule unique

Nathalie Barbier 1
1 Laboratoire Charles Fabry / Biophotonique
LCF - Laboratoire Charles Fabry
Résumé : La synthèse des protéines est un mécanisme central de la vie cellulaire dont la compréhension est un enjeu pour la recherche biomédicale. Des phénomènes comme les erreurs programmées de la traduction eucaryote ou l’initiation par des structures IRES virales sont impliqués dans les processus de réplication de virus et de bactéries. Mieux appréhender ces processus est une étape essentielle pour aboutir au développement d’approches thérapeutiques innovantes. Les études en molécule unique permettent d’observer chaque système réactionnel individuellement et donnent accès à des évènements asynchrones difficilement observables en mesure d’ensemble, tels la traduction de protéines. Ce manuscrit de thèse présente une approche d’étude de la traduction par un ribosome eucaryote (mammifère) en molécule unique. Nous observons les systèmes traductionnels grâce à des marqueurs fluorescents liés à des oligonucléotides pouvant s’hybrider sur les séquences d’ARN messagers traduites. L’observation de ces marqueurs est faite par microscopie de fluorescence en réflexion totale (TIRFM), les ARNm étant accrochés à la surface de l’échantillon. En lisant l’ARNm, le ribosome détache les marqueurs, et leurs instants de départ nous permettent de remonter à la dynamique de traduction de ribosomes individuels. Cette méthode permet d’obtenir des données cinétiques statistiques sur un grand nombre de systèmes traductionnels en parallèle pouvant alors être ajustées par des lois de probabilité. Partant de ce principe, mes travaux de thèse ont eu pour objectif d’étendre nos expériences à une nouvelle problématique biologique : l’étude des évènements non canoniques de la traduction eucaryote. Pour cela nous avons apporté les modifications et les optimisations nécessaires au dispositif et au protocole expérimental pour l’adapter à ces nouveaux enjeux. Nos mesures de la cinétique in vitro de l’élongation eucaryote ont mis à jour un délai dû à une initiation non-canonique. En effet, nous réalisons le recrutement du ribosome par l’ARNm grâce à une structure virale de type IRES. Dans nos conditions d’expérience, l’incorporation d’un acide aminé prend environ une seconde tandis que cette structure induit un retard à la traduction de plusieurs dizaines de secondes. Nous avons réalisé une étude comparative de plusieurs de ces structures virales et avons montré que le délai mesuré était une caractéristique conservée dans le cadre de l’initiation non canonique. Ce résultat ouvre des perspectives d’études cinétiques tant pour approfondir nos conclusions sur les IRES que pour aborder d’autres évènements non canoniques tel que le décalage de la phase de lecture ou le franchissement du codon stop.
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Thèse
Optique [physics.optics]. Université Paris-Saclay, 2017. Français. 〈NNT : 2017SACLO005〉
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Soumis le : lundi 4 décembre 2017 - 09:12:32
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Nathalie Barbier. Etude des erreurs programmées du ribosome par microscopie de fluorescence en molécule unique. Optique [physics.optics]. Université Paris-Saclay, 2017. Français. 〈NNT : 2017SACLO005〉. 〈tel-01654479〉

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