Etude des erreurs programmées du ribosome par microscopie de fluorescence en molécule unique

Nathalie Barbier 1
1 Laboratoire Charles Fabry / Biophotonique
LCF - Laboratoire Charles Fabry
Résumé : La synthèse des protéines est un mécanisme central de la vie cellulaire dont la compré-hension est un enjeu pour la recherche biomédicale. Des phénomènes comme les erreurs programméesde la traduction eucaryote ou l’initiation par des structures IRES virales sont impliqués dans les processusde réplication de virus et de bactéries. Mieux appréhender ces processus est une étape essentiellepour aboutir au développement d’approches thérapeutiques innovantes. Les études en molécule uniquepermettent d’observer chaque système réactionnel individuellement et donnent accès à des évènementsasynchrones difficilement observables en mesure d’ensemble, tels la traduction de protéines.Ce manuscrit de thèse présente une approche d’étude de la traduction par un ribosome eucaryote(mammifère) en molécule unique. Nous observons les systèmes traductionnels grâce à des marqueursfluorescents liés à des oligonucléotides pouvant s’hybrider sur les séquences d’ARN messagers traduites.L’observation de ces marqueurs est faite par microscopie de fluorescence en réflexion totale (TIRFM),les ARNm étant accrochés à la surface de l’échantillon. En lisant l’ARNm, le ribosome détache lesmarqueurs, et leurs instants de départ nous permettent de remonter à la dynamique de traductionde ribosomes individuels. Cette méthode permet d’obtenir des données cinétiques statistiques surun grand nombre de systèmes traductionnels en parallèle pouvant alors être ajustées par des lois deprobabilité. Partant de ce principe, mes travaux de thèse ont eu pour objectif d’étendre nos expériencesà une nouvelle problématique biologique : l’étude des évènements non canoniques de la traductioneucaryote. Pour cela nous avons apporté les modifications et les optimisations nécessaires au dispositifet au protocole expérimental pour l’adapter à ces nouveaux enjeux.Nos mesures de la cinétique in vitro de l’élongation eucaryote ont mis à jour un délai dû à uneinitiation non-canonique. En effet, nous réalisons le recrutement du ribosome par l’ARNm grâce àune structure virale de type IRES. Dans nos conditions d’expérience, l’incorporation d’un acide aminéprend environ une seconde tandis que cette structure induit un retard à la traduction de plusieursdizaines de secondes. Nous avons réalisé une étude comparative de plusieurs de ces structures viraleset avons montré que le délai mesuré était une caractérisitique conservée dans le cadre de l’initiation noncanonique. Ce résultat ouvre des perspectives d’études cinétiques tant pour approfondir nos conclusionssur les IRES que pour aborder d’autres évènements non canoniques tel que le décalage de la phase delecture ou le franchissement du codon stop.
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Thèse
Optique [physics.optics]. Université Paris-Saclay, 2017. Français. 〈NNT : 2017SACLO005〉
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Soumis le : lundi 4 décembre 2017 - 09:12:32
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Nathalie Barbier. Etude des erreurs programmées du ribosome par microscopie de fluorescence en molécule unique. Optique [physics.optics]. Université Paris-Saclay, 2017. Français. 〈NNT : 2017SACLO005〉. 〈tel-01654479〉

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