Miniaturization of sample preparation in bottom-up proteomics for the quantification of cystein oxidation - Archive ouverte HAL Access content directly
Theses Year : 2019

Miniaturization of sample preparation in bottom-up proteomics for the quantification of cystein oxidation

Miniaturisation de la préparation d'échantillon en protéomique bottom-up pour la quantification de l'oxydation des cystéines

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Abstract

Bottom-up proteomics is the most commonly used approach for protein analysis by mass spectrometry. In this approach, enzymatic digestion is one step of a long and tedious sample preparation protocol. Specific care is needed to study post-translational changes, such as cysteine oxidation, with additional steps which makes the protocol even more complex. The OcSILAC protocol, developed in our laboratory for quantifying cysteine oxidation, is a perfect illustration of this. The miniaturization of the experimental setup is an opportunity for the OcSILAC protocol to be less time and sample consuming. It is the objective of my thesis project.A microfluidic device, inspired by the Filter Aided Sample Preparation (FASP) method, was developed during this project. It is a PDMS device, incorporating a regenerated cellulose molecular filtration membrane and manufactured by gentle photolithography. In the literature, the majority of microfluidic devices dedicated to proteomics stops at proof of concept on standard reference proteins. The microchip developed during this thesis allowed the analysis of biological complex protein samples: with ten times less sample and an eight-times shorter protocol than conventional procedures. Our ChipFilter Proteolysis protocol can identify more proteins and more peptides than the previously reported FASP method. For the miniaturization of the OcSILAC protocol, the development of a biotinylated peptide enrichment unit was started using avidin magnetic beads
RésuméLa protéomique bottom-up est l'approche la plus couramment utilisée pour l'analyse des protéines par spectrométrie de masse. Dance cette approche, la digestion enzymatique s'intègre dans une étape de préparation d'échantillon longue et fastidieuse. Les précautions nécessaires à l'étude des modifications post traductionnelles comme l'oxydation des cystéines introduisent des étapes supplémentaires et rendent le protocole plus complexe. Le protocole OcSILAC, développé dans notre laboratoire pour la quantification de l'oxydation des cystéines, en est une parfaite illustration. La miniaturisation du protocole OcSILAC pour le rendre moins chronophage et consommateur d'échantillon est l'objectif de mon projet de thèse.Un dispositif microfluidique, inspiré de la méthode Filter Aided Sample Preparation (FASP), a été développé durant mes travaux de thèse. C'est un dispositif en PDMS, intégrant une membrane de filtration moléculaire en cellulose régénérée et fabriqué par photolithographie douce. Dans la littérature scientifique, la majorité des dispositifs microfluidiques dédiés à la protéomique s'arrête aux preuves de concept. La micropuce développée au cours de cette thèse a permis l'analyse d'échantillons protéiques complexes en moins de temps et avec moins d'échantillons que les méthodes conventionnelles. Avec 10 fois moins d'échantillon et un protocole 8 fois moins long, la digestion sur puce permet d'identifier plus de protéines et plus de peptide par protéine identifiée par rapport à la méthode FASP. Pour la miniaturisation complète du protocole OcSILAC, une unité d'enrichissement des peptides biotinilés a été mise au point en utilisant des billes aimantées.
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Cite

Massamba Ndiaye. Miniaturisation de la préparation d'échantillon en protéomique bottom-up pour la quantification de l'oxydation des cystéines. Chimie analytique. Université Paris sciences et lettres, 2019. Français. ⟨NNT : 2019PSLET064⟩. ⟨tel-03003473⟩
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