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Theses Year : 2021

Development of new analytical methods for the analysis at the intact level of glycoforms of hCG and other gonadotropins by nano liquid chromatography hyphenated to high resolution mass spectrometry

Développement de nouvelles méthodes analytiques pour l'analyse au niveau intact de glycoformes d'hCG et d'autres gonadotrophines par nano chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse haute résolution

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Abstract

Glycosylation is the attachment of glycans to a protein, so-called a glycoprotein. It is one of the most common post-translational modifications and it impacts protein activity and stability. Human chorionic gonadotropin (hCG) is a highly glycosylated protein, composed of two subunits, hCGα and hCGβ, having in total four N- and four O-glycosylation sites, leading to a very high number of glycoforms. However, the glycosylation state of this hormone essential for pregnancy was associated with some pregnancy pathologies. For this reason, it is necessary to be able to analyze the hCG glycoforms present in biological samples. In this work, new analytical methods for the analysis at the intact level of hCG glycoforms by nano liquid chromatography (nanoLC) hyphenated with mass spectrometry (MS) were developed. The miniaturization of the separation allowed an increase in sensitivity and its coupling with a high mass accuracy and high mass resolution analyzer, an Orbitrap, allowed the detection and semi-quantification of several α-subunit glycoforms in hCG-based drugs, but also of another gonadotropin sharing the same α-subunit, the follicle-stimulating hormone (FSH). The optimization of both a preconcentration step in the nanoLC-MS set-up and of the mobile phase gradient and nature allowed the detection of hCGβ glycoforms for the first time and also of a higher number of hCGα glycoforms. Next this analytical method using either formic acid or trifluoroacetic acid as mobile phase additive was evaluated for the detection of the α- and β-subunits of different recombinant or urinary gonadotropin-based drugs. Finally, with the aim to determine hCG glycoforms in serum of pregnant women, i.e complex biological samples, rather than in concentrated and fairly pure gonadotropin-based drugs, it was necessary to develop a selective extraction step of hCG glycoforms before their analysis in nanoLC-MS. This is why, immunosorbents were synthesized by immobilizing two different anti-hCG antibodies on a solid sorbent. The primary experiments of hCG immunoextraction showed promising results.
La glycosylation est l’addition de glycanes sur une protéine, appelée alors glycoprotéine. C'est l'une des modifications post-traductionnelles les plus courantes et elle a un impact sur l'activité et la stabilité de la protéine. L’hormone chorionique gonadotrope humaine (hCG), appelée communément hormone de grossesse, est une protéine hautement glycosylée, composée de deux sous-unités, hCGα et hCGβ, ayant au total quatre sites de N- et quatre sites de O-glycosylation, conduisant à un nombre très élevé de glycoformes. Or, l’état de glycosylation de cette hormone essentielle de la grossesse a été associé à certaines pathologies de celle-ci. C'est pourquoi il est nécessaire de pouvoir analyser les glycoformes de la hCG présentes dans des échantillons biologiques. Dans ces travaux, de nouvelles méthodes ont été développées pour l'analyse à l’échelle intacte des glycoformes de la hCG par nanochromatographie en phase liquide (nanoLC) couplée à la spectrométrie de masse (MS). Le format miniaturisé de la séparation a permis une augmentation de la sensibilité de la méthode et son couplage avec un analyseur de haute précision et haute résolution en masse, un Orbitrap, a permis de détecter et de semi-quantifier plusieurs glycoformes de la sous-unité α dans des médicaments à base de hCG, mais aussi d’une autre gonadotrophine partageant la même sous-unité α, l'hormone folliculo-stimulante (FSH). L’optimisation d'une étape de préconcentration en amont de la nanoLC-MS et du gradient de phase mobile et de sa nature ont permis ensuite de détecter des glycoformes de la hCGβ pour la première fois et d'un plus grand nombre de glycoformes de la hCGα. Puis, cette méthode analytique utilisant soit de l'acide formique soit de l'acide trifluoroacétique comme additif de la phase mobile a été évaluée pour la détection des glycoformes des sous-unités α et β de différents médicaments à base de gonadotrophines d’origine recombinante ou urinaire. Enfin, dans le but de déterminer les glycoformes de la hCG dans le sérum de femmes enceintes, c'est-à-dire dans des échantillons biologiques complexes plutôt que dans des médicaments concentrés et relativement purs à base de gonadotrophines, il a été nécessaire de développer une étape d'extraction sélective des glycoformes de la hCG avant leur analyse par nanoLC-MS. Ainsi, des immunoadsorbants ont été synthétisés en immobilisant deux anticorps anti-hCG différents sur un support solide. Les premières expériences d'immunoextraction de la hCG ont donné des résultats prometteurs.
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Cite

Amira Al Matari. Development of new analytical methods for the analysis at the intact level of glycoforms of hCG and other gonadotropins by nano liquid chromatography hyphenated to high resolution mass spectrometry. Analytical chemistry. Université Paris sciences et lettres, 2021. English. ⟨NNT : 2021UPSLS034⟩. ⟨tel-03270927⟩
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