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Theses Year : 2021

Electron microscopy study of Formin conformations during actin filament assembly

Etude par microscopie électronique des conformations structurales adoptées par la Formine durant l'assemblage de filaments d'actine

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Abstract

Formins are key regulators of the assembly of actin filaments in cells. Formins induce the nucleation and rapid elongation of actin filaments. The activity of formins thus participates in the generation of functional structures such as filopodia, stress fibers or the cytokinetic ring. Hence, formins are involved in fundamental cellular processes such as migration or cell division. At the molecular level, formins are homodimers capable of interacting with the barbed ends of elongating actin filaments via their FH2 domains. The conformational changes involved in tracking the barbed ends have never been directly observed. However, a set of biochemical, biophysical and structural biology studies evidence that the FH2 dimer moves stepwise at the barbed end, following an equilibrium between two states : "closed" and "opened". In the closed state, no new actin subunit can be added to the barbed end, while it is allowed in the opened state. Several models, under discussion, describe the structural nature of these two states and how they alternate. One can then evoke the « stair-stepping » model and the « stepping second » model.My thesis aims at elucidating the debate about the conformational states adopted by formin at the barbed end, focusing on the mammalian formin mDia1. Our goal was undertaken using electron microscopy. So far, formins bound to the barbed ends of actin has not been described using electron microscopy. Indeed, to pursue single particle analysis by EM, a sufficient density of objects of interest randomly oriented have to be displayed within an image. Formins bound to actin rapidly generate long filaments, preventing the obtention of enough short filaments exhibiting formins at their barbed ends. Thus, a bottleneck had to be overcome to make the samples suitable for single particle structural analysis. A sonication approach was chosen to produce short actin filaments. A first 3D reconstruction of the FH2 dimer-actin complex was obtained from negative stain electron microscopy samples. This envelope corresponds to the open state of the « stair stepping » model. After optimizing the image analysis protocol, a second 3D conformation of the complex could be determined, corresponding to the closed state of the so-called « stair stepping » model, which was minoritary. A further 2D study also revealed conformational variations within the open state. These observations led to the hypothesis that, for extreme conformations, the FH2 dimer can be found not only at the barbed end but also on the body of the actin filaments. The search for such a configuration could be validated by 2D analyses and a preliminary 3D density of an FH2 dimer complex encircling the body of an actin filament. We have adapted our samples to cryo-electron microscopy. Graphene-Oxide was added to the surface of the EM grids to preserve a sufficient actin filament ends density. A limited quantity of filament ends could be analyzed through 2D and 3D classifications. It thus confirms the non-artefactual nature of the previously observed open state.In addition, through a collaborative project, I also showed the synergistic action of Formin with Arp2/3 in the presence of Spin90 by highlighting the formation of a tetramer.
Les Formines sont des protéines régulatrices clés pour l'assemblage de filaments d'actine dans les cellules. Les formines y stimulent la nucléation et l'élongation rapide de filaments d'actine. L’activité des formines participe ainsi à la génération de structures fonctionnelles et se retrouvent impliquées dans des processus cellulaires fondamentaux comme la migration ou la division cellulaire. À l’échelle moléculaire, les formines constituent des homodimères capables d’interagir avec les extrémités barbées des filaments d’actine en élongation via leurs domaines FH2. Bien que les changements conformationnels impliqués dans cette traque des bouts barbés n'aient jamais été observés directement, des études de biochimie, biophysique et biologie structurale suggèrent que le dimère de FH2 se déplace pas à pas à l'extrémité barbée polymérisante, à travers un équilibre entre deux états dits "fermé" et "ouvert". Dans l’état fermé, aucune nouvelle sous-unité d’actine ne peut être ajoutée à l’extrémité barbée tandis que cet évènement est permis dans l’état ouvert. Plusieurs modèles coexistent et sont en discussion pour décrire la conformation structurale de ces deux états ainsi que la transition de l’un vers l’autre. On peut alors évoquer le modèle de la « marche enjambée » et le modèle du « saut enclenché ».Mon projet de recherche a eu pour objet de lever les interrogations qui persistent quant à la nature des états conformationnels adoptés par la formine au bout barbé, plus particulièrement pour la formine de mammifère mDia1. Pour cela j’ai utilisé essentiellement des méthodes de biologie structurale par microscopie électronique. Aucune structure en microscopie électronique n’avait été obtenue jusqu’à présent. En effet, rapidement, en présence de formines, de longs filaments d’actine sont générés et ne permettent pas l’obtention d’une densité élevée de courts filaments coiffés de formines, nécessaire à une analyse en particules isolées. Un goulot d'étranglement a donc dû être surmonté afin d’optimiser les échantillons pour une telle analyse. Une approche par sonication a ainsi été choisie. Une première enveloppe 3D du complexe formé par l’extrémité barbée et le dimère de FH2 a pu être déterminée en coloration négative. Cette enveloppe correspond à l’état ouvert du modèle de la « marche enjambée ». Après une optimisation du protocole de traitement d’images, une seconde conformation 3D du complexe a pu être déterminée correspondant cette fois à l’état fermé du modèle de la « marche enjambée » minoritaire. Une étude à deux dimensions plus poussée a également permis de mettre en évidence des variations conformationnelles au sein même de l’état ouvert. Ces observations ont permis de proposer l'hypothèse que, pour des conformations extrêmes, le dimère de FH2 peut se retrouver non plus à encercler l’extrémité barbée mais le corps même des filaments d’actine. La recherche d’une telle configuration a pu être validées par des analyses 2D ainsi qu’une densité 3D préliminaire d’un complexe d’un dimère de FH2 encerclant le corps d’un filament. L’adaptation de mes échantillons vers la cryo-microscopie a été débutée. En particulier, des feuilles d'oxide de graphène ont été déposées sur les grilles de microscopie pour conserver une densité d’extrémités de filaments d’actine suffisante. Une quantité limitée d’extrémités a pu être analysée par classification 2D et 3D confirmant tout au moins la nature non artéfactuelle de l’état ouvert précédemment observé.Enfin, j’ai également pu contribuer à travers cette thèse à l’étude de l’action synergique de la Formine avec Arp2/3 en présence de Spin90 via la mise en évidence d’un complexe tétramérique.
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Dates and versions

tel-03344046 , version 1 (14-09-2021)

Identifiers

  • HAL Id : tel-03344046 , version 1

Cite

Julien Maufront. Etude par microscopie électronique des conformations structurales adoptées par la Formine durant l'assemblage de filaments d'actine. Biologie cellulaire. Université Paris sciences et lettres, 2021. Français. ⟨NNT : 2021UPSLS049⟩. ⟨tel-03344046⟩
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