Application of the scale-down methodology to study the effect of mixing on Trichoderma reesei physiology and enzyme production performance
Application de la méthodologie scale-down à l’étude de l’effet du mélange sur la physiologie de Trichoderma reesei et ses performances de production d’enzymes
Résumé
Industrial production process of cellulases involves the aerobic filamentous fungus Trichoderma reesei, as it displays a high secretion capacity. Scaling-up this process is a prerequisite to allow the ethanol production processes from lignocellulosic biomass to be economically viable. However, this scale-up is challenging because the filamentous morphology of the fungus increases the medium viscosity. This leads to spatial and temporal heterogeneities within the culture, especially in terms of dissolved oxygen concentration, which negatively affect the enzyme production. This thesis aimed at studying the effects of mixing, by considering fluid dynamic stress and dissolved oxygen gradients, on T. reesei physiology and ability to produce cellulases. The scale-down methodology was employed to reproduce at bench scale the constraints encountered in large scale bioreactors. The impact of fluid dynamic stress on cellulases production was considered in continuous mode, using two levels of fluid dynamic stress. Our results showed that the intracellular proteins synthesis and the cellulases production by T. reesei were both affected by high fluid dynamic stress, but in a limited way. The effect of the oxygen gradients was studied in fed-batch cultures using three scale-down approaches: Two Bizone systems, consisting of two connected bioreactors, the biggest one being aerated and the smallest one not (or conversely) and a single bioreactor to which a dynamic variation of the pO2 was applied. Cellulases production was reduced when the fungus encountered anaerobiosis. However, small bubbles included in the viscous medium helped maintaining a low level of dissolved oxygen, thus limiting the deleterious effect of anaerobiosis. Our work also highlighted the rise of a non-producing variant of T. reesei when the population faced hypoxia. This sub-population induced a strong reduction of the bioprocess performances. In addition, the development of original models highlighted the importance of considering the hold-up due to small bubbles, to properly describe T. reesei behavior. Finally, this work demonstrated the “robustness” of the fungus when it faces fluid dynamic stress and heterogeneities that are likely to appear at large scale.
Les cellulases industrielles sont principalement produites par un champignon filamenteux aérobie, Trichoderma reesei, en raison de sa grande capacité de sécrétion. L’extrapolation du procédé de production de cellulases est une condition préalable pour que les procédés de production d’éthanol à partir de biomasse lignocellulosique soient viables. Cette extrapolation est cependant difficile car la morphologie filamenteuse induit une augmentation de la viscosité du milieu, ce qui conduit à des hétérogénéités spatiales et temporelles au sein de la culture, notamment en termes de concentration en oxygène dissous, affectant négativement la production d’enzymes. L’objectif de cette thèse est d’étudier les effets du mélange de la culture, en termes de stress hydrodynamique et de gradients en oxygène dissous, sur la physiologie et la capacité de production de cellulases par T. reesei. Afin de reproduire à l’échelle du laboratoire les contraintes rencontrées à l’échelle industrielle, la méthodologie scale-down a été employée. L’impact du cisaillement sur la production de cellulases a été étudié en mode continu, en employant deux niveaux de stress hydrodynamique. L'effet des gradients d’oxygène a été étudié en cultures fed-batch à l'aide de trois approches scale-down : deux systèmes Bizone, constitués de deux bioréacteurs reliés, le plus grand étant aéré, l’autre non (ou l’inverse pour le système Bizone inversé) et un bioréacteur unique sur lequel une variation dynamique de la pO2 est appliquée. Les résultats montrent que les performances sont dégradées par l’anaérobiose. Toutefois, l’existence de petites bulles d’air, maintenues dans les milieux visqueux, évite que le milieu soit totalement anaérobie, ce qui limite l’effet délétère de l’absence d’oxygène. L’application de périodes d’hypoxie a également permis de faire émerger un variant non producteur, qui induit une baisse importante des performances du bioprocédé. Enfin, le développement de modèles originaux a confirmé l’importance de la prise en compte du hold-up lié aux petites bulles d’air pour bien représenter le comportement de T. reesei. L’ensemble de ces travaux permet enfin de démontrer une certaine « robustesse » du champignon face au cisaillement et aux hétérogénéités susceptibles d’apparaître à l’échelle industrielle.
Origine : Version validée par le jury (STAR)