Drosophila intestinal stem cell response to DNA damage and replication stress
Réponses des cellules souches intestinales de Drosophile aux dommages à l'ADN et au stress de réplication
Résumé
Genome integrity in long-lived tissue stem cells is essential to maintain tissue function and prevent cancer initiation. How stem cells cope with DNA lesions determines their mutation rate, susceptibility to cancer, and likely age-related functional decline. My thesis aimed to understand what are the DNA damage causing factors, and what mechanisms are acting in adult stem cells to prevent spontaneous mutation. Replication stress driven by nucleotide depletion is proposed to increase genome instability in cancer cells, as it may lead to genome rearrangements. However, to what extent replication stress is responsible for genomic alterations in adult stem cells remains unclear. Likewise, the erroneous DNA repair mechanisms acting to repair DNA damage and linked to genome rearrangements are not completely understood. The Drosophila intestine is a good model system to study stem cells and tissue homeostasis and address these questions.The Bardin lab previously showed that different types of somatic mutations are arising in aging intestinal stem cells. Notably, wild type aged male guts frequently develop spontaneous neoplasias due to the inactivation of the tumor suppressor gene Notch by small or large deletions or more complex genomic rearrangements. During my thesis, I first examined how aged stem cells cope with DNA damage. I also helped to characterize the spontaneous formation of neoplasias in different genetic background. Microdissection and DNA extraction of neoplasias for subsequent whole-genome sequencing (work with K. Siudeja) and the development of bioinformatic pipelines (by N. Riddiford), allowed the characterization of the somatic mutations of intestinal stem cells. Since many structural variants identified suggested a DNA repair mechanism relying on microhomologies, I investigated the role of Pol θ, a polymerase involved in microhomology mediated DNA repair, in somatic mutations and neoplasia formation in intestinal stem cells.Several evidence from the sequencing suggested that replication stress might be an important cause of somatic mutation in the stem cells. Therefore, I examined the consequences of nucleotide depletion-induced replication stress on stem cells. Importantly, I developed a cell specific approach to induce replication stress by RnrL knockdown (an enzyme essential for the production of dNTPs). In the gut, the knockdown of RnrL induced DNA damage accumulation in S phase stem cells and proliferation defects, likely leading to stem cell loss. However, I observed that knockdown of RnrL in the developing wing disc rarely induced DNA damage cell autonomously. Following this, I demonstrated a role for GAP junctions in non-cell autonomously limiting replication stress, likely by buffering nucleotide levels between adjacent cells. Finally, I showed that GAP junctions are only localized between enterocytes in the midgut but not in stem cells. Differences in GAP junctions expression could explain tissue and cell specific sensitivity to replication stress and DNA damage.
L'intégrité du génome dans les cellules souches des tissus à longue durée de vie est essentielle pour maintenir la fonction des tissus et prévenir l'apparition de cancers. Comment les cellules souches font face aux lésions de l'ADN détermine leur taux de mutation, leur susceptibilité au cancer, et leur déclin fonctionnel avec l'âge. Ma thèse visait à comprendre les facteurs causant des dommages à l'ADN, et les mécanismes agissant dans les cellules souches adultes pour prévenir les mutations spontanées. Il est proposé que le stress de réplication provoqué par l'appauvrissement en nucléotides augmente l'instabilité du génome dans les cellules cancéreuses, car il peut conduire à des réarrangements du génome. Cependant, on ne sait pas encore dans quelle mesure le stress de réplication est responsable des altérations génomiques dans les cellules souches adultes. De même, les mécanismes de réparation de l'ADN qui agissent pour réparer les lésions de l'ADN et qui sont liés aux réarrangements du génome ne sont pas complètement compris. L'intestin de la drosophile est un bon modèle pour étudier les cellules souches et l'homéostasie des tissus et répondre à ces questions.L’équipe de A. Bardin a précédemment montré que différents types de mutations somatiques apparaissent dans les cellules souches intestinales au cours du vieillissement. Notamment, les intestins mâles âgés développent fréquemment des néoplasies spontanées dues à l'inactivation du gène suppresseur de tumeur Notch par de petites ou grandes délétions ou des réarrangements génomiques plus complexes. Au cours de ma thèse, j'ai d'abord examiné comment les cellules souches âgées font face aux dommages à l'ADN. J'ai également contribué à caractériser la formation spontanée de néoplasies dans différents contextes génétiques. La microdissection et l'extraction de l'ADN des néoplasies pour le séquençage ultérieur du génome (avec K. Siudeja) et le développement de pipelines bioinformatiques (par N. Riddiford), ont permis la caractérisation des mutations somatiques des cellules souches intestinales. Comme de nombreux variants structurels identifiés suggéraient un mécanisme de réparation de l'ADN reposant sur les microhomologies, j'ai étudié le rôle de Pol θ - une polymérase impliquée dans la réparation de l'ADN médiée par les microhomologies - dans les mutations somatiques et la formation de néoplasies dans les cellules souches intestinales.Plusieurs éléments du séquençage ont suggéré que le stress de réplication pourrait être une cause importante de mutation somatique dans les cellules souches. J'ai donc examiné les conséquences du stress de réplication induit par la déplétion de nucléotides sur les cellules souches. J'ai développé une approche cellule-spécifique pour induire le stress de réplication par le knockdown de RnrL (une enzyme essentielle pour la production de dNTPs). Dans l'intestin, le knockdown de RnrL a induit une accumulation de dommages à l'ADN dans les cellules souches en phase S et des défauts de prolifération, conduisant probablement à la perte de cellules souches. Cependant, j'ai observé que le knockdown de RnrL dans le disque d’aile en développement induisait rarement des dommages à l'ADN. Ensuite, j'ai démontré le rôle des jonctions GAP dans la limitation du stress de réplication, probablement en ajustant les niveaux de nucléotides entre cellules adjacentes. Enfin, j'ai montré que les jonctions GAP sont uniquement localisées entre les entérocytes dans l'intestin de drosophile mais pas dans les cellules souches. Les différences d'expression des jonctions GAP pourraient expliquer les différences de sensibilité des tissus et des cellules au stress de réplication et aux dommages à l'ADN.
Origine : Version validée par le jury (STAR)