Investigation of the Cell Membrane Architecture by Single-Molecule Tracking of Peptidic Toxins - Archive ouverte HAL Access content directly
Theses Year : 2010

Investigation of the Cell Membrane Architecture by Single-Molecule Tracking of Peptidic Toxins

Interaction toxine-cellule étudiée par imagerie de nanoémetteurs individuels

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Abstract

The cellular membrane is a vital part of the cell, which plays a crucial role in many cellular processes, such as, signaling and trafficking, and pathologies. This thesis aims to investigate the architecture of the cell membrane. The study uses the motion of two membrane receptors that are exploited by bacterial toxins to probe the architecture. Advances in light microscopy techniques have shown that many membrane receptors do not diffuse freely in the membrane, but undergo confined or anomalous diffusion. Currently a few models compete to explain the confinement of the receptors, such as the Picket-Fence model, lipid rafts and protein aggregates. To investigate the membrane, lanthanide doped nanoparticles (Y0.6Eu0.4VO4) are coupled to two different peptidic pore-forming toxins, the α-toxin of C. septicum and the ǫ-toxin of C. perfingens. Single molecule tracking of receptor bound labeled toxins in the apical membrane of MDCK cells in a wide-field microscope reveals the receptor motion with sub-diffraction resolution of down to 10 nm. The α & ǫ-toxin receptors both undergo confined diffusion with similar diffusion coefficients of 0.16 ± 0.14 µm2/s in temporaly stable domains of 0.5 µm2. To analyze the receptor trajectories, we intro- duced a novel approach based on an inference method. Our only assumption is that the receptor moves according to the Langevin equation of motion. This method exploits the information of the ensemble of the trajectory and the quality of the extracted values is verified through simulations. Both receptors are confined in a spring-like potential with a spring constant of 0.45 pN/µm. Tracking after cholesterol depletion by cholesterol ox- idase and cytoskeleton depolymerization by Latrunculin B, shows that confinement of single receptors is cholesterol dependent and actin depolymerization does not influence the confinement. Using the nanoparticle labels as a hydrodynamic force amplifier in a liquid flow, tests the response of the receptor to an external force and indicates attach- ment of the confining domains to the cytoskeleton. Finally, a model for the confinement of the receptor is proposed, based on the hydrophobic coupling of the receptor and the surrounding bilayer which can explain the spring-like potential of the confining domain.
La membrane cellulaire est une partie vitale de la cellule dont l'architecture joue un rˆole crucial dans de nombreux processus cellulaires, comme la signalisation et le trafic, et dans diverses pathologies. Cette th'ese vise 'a sonder l'architecture membranaire via le mouvement de deux r'ecepteurs membranaires qui sont exploit'es par des toxines bact'eriennes. Les progr'es r'ecents des techniques de microscopie optique ont montr'e que certains r'ecepteurs membranaires ne diffusent pas librement dans la membrane, mais sont confin'es ou diffusent de fa¸con anomale. Actuellement, plusieurs mod'eles con- courent pour expliquer le confinement des r'ecepteurs, tel que le mod'e le Picket-Fence, les radeaux lipidiques et les agr'egats de prot'eines. Pour sonder la membrane, des nanoparticules (Y0.6Eu0.4VO4) dop'ees avec des lan- thanides sont coupl'ees 'a deux toxines peptidiques diff'erentes formant des pores dans la membrane, la toxine α de C. septicum et la toxine ǫ de C. perfingens. Le suivi de r'ecepteurs individuels sur lesquels sont fix'ees des toxines marqu'ees dans la mem- brane apicale de cellules MDCK avec un microscope 'a champ large permet de d'etecter le mouvement du r'ecepteur avec une r'esolution meilleure que la limite de diffrac- tion. Les r'ecepteurs de la toxine α et ǫ montrent une diffusion confin'ee avec des coefficients de diffusion similaires de 0.16 ± 0.14 µm2/s dans des domaines stables de 0.5 µm2. Pour analyser les trajectoires des r'ecepteurs, nous avons mis en oeuvre une nouvelle technique bas'ee sur une m'ethode d'inf'erence. Notre seule hypoth'ese est que le r'ecepteur se d'eplace selon l''equation de Langevin. Cette m'ethode exploite l'ensemble de l'information stock'ee dans la trajectoire et la qualit'e des valeurs extraites est v'erifi'ee par des simulations. Les deux r'ecepteurs sont confin'es dans un potentiel de type ressort avec une raideur de 0.45 pN/µm. Des exp'eriences apr'es d'epl'etion du cholest'erol par la cholest'erol oxydase et apr'es la d'epolym'erisation du cytosquelette par latrunculin B montrent que le confinement des r'ecepteurs individuels d'epend du taux de cholest'erol et que la d'epolym'erisation de l'actine n'influence pas le confinement. En utilisant la nanoparticule coupl'ee aux toxines comme un amplificateur de la force hydrodynamique applique'e par un flux liquide, nous avons mesur'e la r'eponse du r'ecepteur 'a une force ext'erieure. Les r'esultats indiquent une fixation des domaines de confinement sur le cy- tosquelette. Enfin, un mod'ele pour le confinement du r'ecepteur est propos'e, bas'e sur le couplage hydrophobe entre le r'ecepteur et la bicouche lipidique qui l'entoure. Ce mod'ele permet d'expliquer le potentiel de type ressort 'a l'int'erieur du domaine de confinement.
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Dates and versions

tel-00608124 , version 1 (12-07-2011)
tel-00608124 , version 2 (25-07-2011)

Identifiers

  • HAL Id : tel-00608124 , version 2

Cite

Silvan Türkcan. Investigation of the Cell Membrane Architecture by Single-Molecule Tracking of Peptidic Toxins. Physics [physics]. Ecole Polytechnique X, 2010. English. ⟨NNT : ⟩. ⟨tel-00608124v2⟩
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